一种改良的耶尔森氏菌YadA蛋白提纯方法

本文介绍了一种改良的耶尔森氏菌ＹａｄＡ蛋白的提纯方法，该法省去了超声破碎菌体和超高离心等步骤，从而使之简便易行，得率高于原法。

灰旱獭-长尾黄鼠鼠疫疫源地监测中应用ELISA检测F1抗体的可行性分析

目的观测灰旱獭-长尾黄鼠鼠疫疫源地监测中应用酶联免疫吸附试验夹心法(ELISA)检测鼠疫F1抗体的效果,分析应用前景。方法 ELISA和间接血凝试验(IHA)同步检测动物血清鼠疫F1抗体,比较两种方法的阳性率、反应滴度。结果 ELISA和IHA检测血清的鼠疫F1抗体,长尾黄鼠阳性率分别为11.71%(118/1 008)和1.73%(21/1 216),平均滴度分别为27.805和21.254;牧犬阳性率分别为38.89%(28/72)和10.71%(7/75),平均滴度分别为27.731和21.50。ELISA检测长尾黄鼠、牧犬血清鼠疫F1抗体的阳性率和平均滴度均高于IHA,差异非常显著(P<0.001)。结论两种方法同步用于鼠疫监测,可及时发现并纠正单一方法因试剂变质或失效出现的错误结果,为制定防控措施提供准确的监测资料。

新疆大沙鼠鼠疫传播媒介的初步调查

目的明确新疆大沙鼠鼠疫的传播媒介。方法以常规方法在鼠体和鼠洞收集寄生物。结果在鼠体和鼠洞采到蚤类4属7种,经病原学检验,从臀突客蚤(Xenopsylla m inax)中分离出5株鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis),从长吻角头蚤(Echidnophaga oschanini)中分离出1株鼠疫菌。结论从臀突客蚤中分离出鼠疫菌在中国尚属首次。臀突客蚤是新疆大沙鼠鼠疫的主要传播媒介。

塔里木盆地子午沙鼠对喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌的感受性实验

目的 研究塔里木盆地子午沙鼠 (Merionesmeridianus)对从新疆和田喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地分离的 470 0 4号鼠疫菌、乌恰县灰旱獭体分离的 2 110 6号菌株和内蒙古长爪沙鼠体分离的 980 0 5号鼠疫菌株感染子午沙鼠在病理改变、感受性、敏感性、二次感染后抗性等方面有无差异 ,仔鼠体内的母系抗体维持时间。方法 用分离自喜马拉雅旱獭体的鼠疫菌 470 0 4号 ,以 1× 10 1 ～ 1× 10 1 0 个菌皮下接种从塔里木盆地捕获的子午沙鼠。结果 本次试验株与 980 0 5株不同剂量感染后死亡情况大致相同 ,二者与 2 110 6株感染结果有较大差异。二次接种 1× 10 1 0 个鼠疫菌 ,存活鼠在饲养 5个月、10个月后产仔 ,从父本、母本、仔鼠体内均测出鼠疫F1抗体。结论 2 110 6株对子午沙鼠的LD50 与 980 0 5株和本次试验株LD50 有较大差异 ,前者毒力较强。再次证实子午沙鼠♀鼠抗体可通过胎盘传递 ,且仔鼠至少能维持抗体

新疆阿拉套山发现鼠疫自然疫源地

目的 查清阿拉套山是否存在鼠疫自然疫源地 ,以及相关的动物和昆虫区系。方法 应用流行病学、医学动物昆虫学、血清学和细菌学等方法。结果 调查区内共采集啮齿动物 10种 ,优势动物为灰旱獭 (Marmotabaibacina) ,次为长尾黄鼠 (Citellusundulatus)与灰旱獭在同一生境 ;灰旱獭定点观察密度为 2 .5～ 5 .5只 /hm2 ;旱獭路线密度最高 2 .3 6只 /hm2 ,最低仅为 0 .0 1只 /hm2 。旱獭洞干蚤染蚤率 0 .3 6%、灰旱獭体蚤染蚤率为 6.2 %。采集小型鼠类的蚤类 18种 ,蜱 2种 ,虱 1种。灰旱獭体蚤主要为谢氏山蚤和似升额蚤及草原硬蜱。检查鼠类血清标本 180份 ,其中灰旱獭阳性血清 2份 ;牧狗血清 114份 ,阳性 1份。从自毙旱獭中 ,分离出 4株鼠疫菌。结论 首次判定新疆阿拉套山存在鼠疫自然疫源地。

耶尔森氏菌外膜蛋1（Yop1）的提取纯化与鉴定

耶尔森氏菌外膜蛋白（Ｙｏｐｓ）在菌体中所占比例甚小，因而提取与纯化均有一定难度，国内尚无成功的先例。我们使用了一种盐析加电泳的方法提取了Ｙｏｐ１蛋白。实验结果表明，该法简便、易行且重复性好、回收率高。使用本法提取假结核耶氏菌外膜蛋白１（Ｙｏｐ１），自每升培基增殖的菌体中（约４．５ｇ湿重），可获得纯品６．３ｍｇ，回收率高于国外同类研究的６倍以上［１］。一次性提取的Ｙｏｐ１蛋白在十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）中共显示出三条可辩认的蛋白带，其分子量依次为１５０ＫＤ，９０～１００ＫＤ及４５～５０ＫＤ。进一步的尿素－十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，样品中的约１００ＫＤ和５０ＫＤ两种蛋白实际为１５０ＫＤ蛋白解聚后的二聚体和单体，根据这一结果，推测该种蛋白系三聚体，其单体分子量为４５～５０ＫＤ。

鼠疫菌pH6抗原的提取、纯化与鉴定

使用ＫＣＮＳ解离、硫酸铵沉淀、电泳制备分离并纯化了鼠疫菌ｐＨ６抗原。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图型显示，提取物为单一蛋白，参照标准，推算其分子最约１５ｋＤ。多数情况下，在其上方尚有一条含最较低、表征分子量约１６ｋＤ的蛋白带，用Ｆ１单克隆抗体及１５ｋＤ蛋白制备的抗血清分别进行测定，该蛋白仅能与１５ｋＤ蛋白的抗血清产生高滴度反应，从而排除了其为Ｆ１抗原的可能性。依据上述实验结果并结合ＬｉｎｄｌｅｒＬＫ等的资料分析，该蛋白与提纯抗原属同一物质，表征分子量间的差异，很可能是分子量较大的一种（约１６ｋＤ）带有一段１ＫＤ的信号序列所致。用精制的ｐＨ６抗原免疫小鼠４只，所有小鼠于初次免疫后的第３０天放血测定，均与提纯抗原出现了高滴度的阳性反应，说明尽管提纯蛋白的方法不够温和，有可能使蛋白发生变性，但其免疫原性基本不受影响，做一般使用时可不做复性处理。

塔里木盆地子午沙鼠对内蒙古长爪沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的感受性实验

为研究塔里木盆地子午沙鼠 (Merionesmeridianus)对鼠疫菌的感受性、敏感性及仔鼠体内是否存在母系抗体 ,用分离自内蒙古长爪沙鼠体的鼠疫菌 980 0 5号 ,以 1× 10 1～ 1× 10 9个菌皮下接种从塔里木盆地捕获的子午沙鼠。其在病理改变、感受性、敏感性、二次感染后抗性增强等方面 ,与用新疆乌恰县灰旱獭体分离的 2 110 6号菌株感染子午沙鼠的结果大致相同。二次接种 1× 10 9个鼠疫菌 ,存活鼠在饲养 168d后产仔 ,从父本、母本、仔鼠体内测出鼠疫F1抗体 ,证实了子午沙鼠♀鼠抗体可通过胎盘传递。

鼠疫菌pH6抗原的免疫效果观察

对实验条件下鼠疫耶尔森氏菌 p H6抗原的免疫效果及其对鼠疫强毒菌再攻击的保护力进行了观察 :(1)建立了鼠疫菌 p H6抗原的酶联免疫吸附试验 (简称 p H6 Ag- EL ISA)及间接红细胞凝集试验 (简称 p H6 Ag- IHA)检测技术 ,检测敏感、特异 ;(2 )用常规方法免疫小鼠 ,以 p H6 Ag- EL ISA和 p H6 Ag- IHA两种方法进行检测 ,实验动物均出现了较高滴度的免疫反应 ,其最高滴度分别为 1∶ 12 80 0和 1∶ 10 2 40 ;(3)对 40只免疫昆明小鼠进行鼠疫强毒菌攻击 ,其半数致死量虽较对照组稍有提高 ,但保护效果不明显 ;对产生这一结果的原因进行了分析 ,在此基础上 。

耶尔森氏菌外膜蛋白1体外表达条件的观察

使用常规培基孵育耶尔森氏菌一般均能获得满意的增菌效果。有文献报导,不同培基对耶尔森氏菌外膜蛋白(Yops)的表达无显著的影响。然而,我们的实验结果提示,Yop1的体外表达具有严格的培基依赖性,该蛋白仅在只含氨基酸成份的最小培基中才能充分表达,其表达量远高于其他几种常规培基。此外,我们还观测了细菌菌龄对这种蛋白体外表达的影响,结果表明,菌龄也影响着该蛋白的体外表达,但其作用强度不如培基那样显著。转换温度后12小时,膜制剂中Yop1的含量达到高峰,增加孵育时间不能增大含量,反而使其呈明显的下降趋势,温度转换后24小时,表达量仅略高于2.5小时的水平。本文还报导了两种孵育温度(22℃、37℃)以及钙离子对Yop1蛋白表达的作用,所得结论与国外同类研究的结果一致,即与其他Yops不同,yopA基因的表达只受生长温度的控制而与钙离子的存在与否无关。本实验的结果将有助于Yop1蛋白的分析研究,特别是此种蛋白的提取制备。

酶标鼠疫F1 McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用

目的观察酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用效果。方法实验感染鼠疫强毒菌的病死小鼠和处死健康小鼠尸体 ,2 0℃以上室温放置 ,用鼠疫F1McAb酶免疫染色法检测 ,同时用细菌学检验方法分离鼠疫菌和反向血凝试验 (RIHA)检测鼠疫F1抗原。结果直接培养仅从 5d内的鼠尸分离检出鼠疫菌 ,阳性率为 5 3 .3 % ;动物实验检出鼠疫菌的最长时间为 8d ,阳性率为 71.6%。存放 13d内 ,酶免疫染色阳性率为 99.1% ,RIHA阳性率98. 2 % ,用酶免疫染色法和RIHA检测健康动物腐败脏器全部阴性。以上方法检查鼠疫疫区自毙动物标本 12份 ,酶免疫染色法阳性 7份 ,RIHA阳性 6份 ,动物实验阳性 5份 ,直接培养未获得阳性结果。结论酶免疫染色法检查动物腐败脏器中的鼠疫菌具有较高的敏感性和特异性。

耶尔森氏菌YadA蛋白单克隆抗体的研制与鉴定

１．以纯化的ＹａｄＡ蛋白〔１、３〕免疫普通小鼠４只，获得小鼠ＹａｄＡ多克隆抗血清；２．利用上述免疫血清建立了ＹａｄＡ多克隆抗体的ＥＬＩＳＡ检测技术，并对其最适条件进行了观察；３．用纯化的ＹａｄＡ蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠２只，以免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系ＳＰ２／０融合，获得１７株分泌ＹａｄＡ－ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株，将其中４株进行了再克隆，经过半年左右的反复传代及冷冻、复苏测试，抗体分泌稳定；４．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析表明瘤株所分泌的单克隆抗体特异；５．

鼠疫菌pH6抗原单克隆抗体的研制及鉴定

:(1)依据 p H6抗原的生化特征及表达条件 ,对不同温度 (37℃和 2 8℃ )及不同酸碱度 (p H6和 p H7)条件下培养细菌的提取物进行了电泳图型对比 ;(2 )依照上述电泳图型 ,并结合该抗原的分子量 ,确定了 p H6抗原的电泳迁移位置 ;(3)采用 KCNS洗脱、(NH4) 2 SO4盐析、制备电泳的方法提取和纯化了鼠疫耶尔森氏菌 (Yersinia pestis) p H6抗原 ,SDS-PAGE分析表明 ,提取物均一 ,表征分子量符合 ,回收率较高 ;(4)使用纯化抗原免疫普通小鼠 5只、BAL B/ c小鼠 3只 ,免疫效果良好 ,利用获得的免疫血清 ,建立了 p H6抗原多克隆抗体的 EL ISA检测技术 ,应用于融合细胞中阳性克隆的筛检及实验动物的免疫效果评价 ,应用结果证实 ,检测敏感、有效 ;(5 )利用细胞融合技术获得杂交瘤 17株 ,对其中的 4株进行了 3次再克隆并经半年反复冷冻、复苏及上清检测 ,证实瘤株分泌抗体稳定 ;(6 )对所获单抗进行了 Western blotting(蛋白印迹试验 )鉴定 ,结果显示抗体特异。

鼠疫菌6MD质粒编码的纤溶活性对假结核菌外膜蛋白1的特异降解作用

将鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒转入假结核耶尔森氏菌中,该质粒决定了杂交菌株中PstI(45kD),Pla蛋白(37kD,35kD)的合成。杂交株膜蛋白制剂的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图形与其亲本株比较,外膜蛋白1(Yop1)确实发生了降解,但这种作用较弱。值得注意的是在与亲本株菌Yop1蛋白完全相同的迁移位置上仍有相当含量的这种蛋白没有发生降解。这一结果与国外同类研究的结论有显著差异。本文就这种现象可能产生的影响进行了分析。

鼠疫菌pH6抗原的电泳图型识别及其体外表达条件

ｐＨ６抗原是鼠疫菌毒力的重要组成部分，研究结果显示，这种抗原很可能与腺鼠疫的发病机制有关。为提供国内急需的ｐＨ６抗原纯品，研究和观察了该抗原的体外适宜表达条件。结果表明，在四种常规培基中，ｐＨ６抗原均可表达，但在ＬＢ培基中，该抗原的表达量明显高于其他培基。此外，还进行了两种ｐＨ及两种温度条件下该抗原表达量的比较，如预期的那样，该抗原仅在酸性和３７℃条件下最大限度表达。根据该抗原不同时ＰＨ和温度条件下十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ｐＡＧＥ）图型的比较、参照已单体分子量，初步识别了该抗原的电泳图型，为今后进一步提取、纯化这种抗原成分奠定了基础。

1981～1990年新疆发现的鼠疫新疫点

1955～1980年,在新疆的昌吉、呼图壁、玛纳斯、乌苏、精河、尼勒克、阿合奇、阿图什、乌恰、和田县山地发现存在鼠疫疫源地,共查出鼠疫疫点90个,检出鼠疫菌494株。1981～1990年,在上述10个疫源县的7个疫源县中又发现鼠疫新疫点38个,检出鼠疫菌98株。此期间,还查出乌鲁木齐、沙湾、阿克陶。

新疆出血热病毒免疫荧光试验检测结果报告

目的了解新疆出血热(XHF)的自然界分布状况。方法对采自塔里木盆地、准噶尔盆地、伊犁谷地和东疆盆地23个县(市)的96份病原材料分别接种Vero-E6细胞,病原材料经细胞培养后,胰酶消化制备细胞片,应用免疫荧光试验(IFA)对细胞片进行病毒检测。结果96份病原材料中,检出新疆出血热病毒颗粒阳性材料16份,分布地区包括巴楚、于田、轮台、民丰、尉梨、莫索湾、吐鲁番和木垒。结论巴楚、于田、轮台、尉梨、莫索湾和木垒地区存在新疆出血热的自然界分布,而民丰和吐鲁番仅从羊血液标本中查出阳性,不能说明该地区存在新疆出血热的自然界分布。