一种拟南芥基因高效编辑体系研究

CRISPR/Cas9基因编辑系统操作简单易行,无需引入外源基因,生物安全性高。但怎样快速筛选获得不含外源转化元件的基因编辑后代是一个关键技术问题。本研究创造性的将拟南芥种皮特异性启动子At2S3与荧光筛选标记基因mCherry组装进植物基因组定点编辑CRISPR载体pHDE中,以拟南芥as1为靶基因,构建一种通过荧光标记筛选、实现转化后代中Cas9 Free的基因高效编辑体系。结果表明,通过同源重组方法构建的带有筛选标记的CRISPR载体与设计相符,外源插入片段正确。挑选转化后种皮上带有红色荧光标记的阳性种子培育得到T 1代植株,经PCR验证,成功获得as1定点敲除的纯合突变植株,纯合子比率达到40%;挑选T 1代纯合突变上不带荧光的种子,培育得到的T 2代植株中,PCR检测不到Cas9片段,实现了编辑后代的Cas9 Free。本研究构建的一种带有可视化筛选标记的基因高效编辑体系,成功实现编辑后代中无外源插入的Cas9等转化元件,生物安全性高,为基因组定点编辑技术在植物遗传资源改良中的高效利用提供了借鉴与参考。

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T1不含荧光的种子进行培育得到的T2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。

植物细胞分裂素氧化酶基因研究进展

通过梳理已有的研究文献,综述了植物细胞分裂素氧化酶基因的生理功能及其表达调控研究进展。目前,关于CKX基因在农作物方面的研究报道较多,而在木本植物和观赏植物方面的研究却较少。今后可利用生物信息学软件以及基因编辑技术如CRISPR/Cas9系统加强此方面的研究,以加强对木本植物、观赏植物等植物中CKX基因的表达调控研究,更好地调控植物生长发育进程以及响应逆境胁迫,充分挖掘生物资源的潜力。

Pfu DNA聚合酶的表达条件优化及纯化研究

Pfu DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的高保真DNA聚合酶之一。本研究对重组菌株的Pfu酶基因表达条件进行优化,以提高Pfu DNA聚合酶的表达效率。通过在菌液深度OD600=0.87时加入1.5 mmol/L的IPTG进行诱导培养,诱导培养时间为11.03 h,用酶溶法对重组菌株进行破胞提取粗酶液,经热变性法与盐析沉淀法对杂酶进行纯化,最后经过透析后得到纯酶。采用考马斯亮蓝G-250法对酶进行含量测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,最后使用PCR反应检测提纯后的Pfu酶的活性。结果表明优化处理后制备的Pfu DNA聚合酶,其纯度、酶活性和酶特异性均达到市售的Pfu DNA聚合酶水平。本研究为Pfu DNA聚合酶的开发和利用奠定了基础。

基于CRISPR/Cas9技术的同源修复载体构建

为探索利用CRISPR/Cas9系统在拟南芥中进行大片段基因敲除并产生回复突变的可行性及其工作效率进一步精准验证靶基因在植物的生长发育中以及响应逆境胁迫中所起的作用。本研究利用同源重组法将sgRNA和编码Cas9的序列快速连接构建表达载体,同时在载体两端装载缺失片段的同源臂以提供同源重组修复时所需的模板。结果显示,敲除ASⅠ基因的表达载体pHDE-ASⅠ重组子阳性率为100%,同源修复载体pHDE-ASⅠ-EcoRⅠ-mCherry为90.9%,且经测序验证,利用同源重组法所构建的表达载体序列无突变,与原序列高度一致从而实现了同源修复载体的构建。本研究为精准验证靶基因的功能提供了技术指导。