温度响应的黄曲霉毒素B_(1)纳米抗体重组表达、复性及生物活性

将不同长度类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)与纳米抗体融合表达,获得具有温度响应能力的抗黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))纳米抗体。采用递归定向连接克隆得到重组表达载体pET30a-G8-ELP20、pET30a-G8-ELP40、pET30a-G8-ELP60、pET30a-G8-ELP80,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,表达后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析显示4种融合蛋白均以不溶性包涵体形式存在于菌体沉淀中,对其进行变性处理后,分别采用稀释复性、可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)纯化、透析复性、柱上复性4种方式对包涵体蛋白进行复性。SDS-PAGE分析4种复性方式分别获得的4种融合蛋白,结果显示其纯度差异不显著,但ITC纯化蛋白得率最高,分别为83%、90.7%、89.5%、88.3%;间接竞争酶联免疫吸附实验测定复性后融合蛋白活性,结果表明由稀释复性法获得的G8-ELP80重组蛋白IC50最低(4.35 ng/mL);浊度分析法测得融合不同长度ELP标签纳米抗体的相变温度分别为45、38、32、28℃;圆二色谱分析显示4种融合蛋白二级结构均以β-折叠、β-转角为主,与预估结果相符。本研究将ELP标签与抗AFB1纳米抗体融合表达,实现了纳米抗体的温度刺激响应性,系统比较了不同复性方式对蛋白特性的影响,为后续AFB1检测分析提供了基础。

抗黄曲霉毒素B_(1)多价纳米抗体融合蛋白的构建及活性分析

纳米抗体来源于天然缺失轻链的重链抗体可变区,是已知最小抗原结合单元。该研究构建了抗黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))纳米抗体的单价及多价串联体,分别与绿色荧光蛋白(GFP)编码片段融合并克隆至原核表达载体p ET30。以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主,通过异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷诱导,亲和层析技术分别纯化单、双及三价抗AFB_(1)纳米抗体与GFP的融合蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明三种融合蛋白均为可溶性表达,表达量分别为6.0、7.5、4.0 mg/L。采用酶联免疫吸附法和荧光扫描法对重组融合蛋白的抗原识别活性及荧光特性进行测定。结果显示,未融合蛋白、单价及双价串联重组蛋白的半抑制浓度(IC;)分别为12.10、14.10、2.19 ng/m L,表明单价重组蛋白的IC;值与未融合蛋白相似,而双价重组蛋白的IC;值与之相比提高了5.5倍。当浓度为0.7 mg/m L时,两种重组蛋白的荧光强度均可达3000以上,荧光强度与GFP相当,且二价重组蛋白表现出更高的荧光强度;三价串联重组蛋白表现出与抗原的结合活性,但AFB_(1)的阻断活性较差,且荧光强度仅为1700左右。该研究为后续建立基于荧光信号的免疫学检测方法奠定了基础,同时也为优化免疫学检测中纳米抗体亲和活性提供了思路和借鉴。

聚天冬氨酸苄酯改性纳米羟基磷灰石的制备

描述了一种羟基磷灰石(HA)表面改性的制备方法,它是通过L-天冬氨酸-β-苄酯-N-羧酸酐开环聚合的方法制得。首先,将HA和硅烷偶联剂KH-550反应得到表面含有活性氨基的改性羟基磷灰石(HAAPS)。其次,HAAPS引发L-天冬氨酸-β-苄酯-N-羧酸酐(BLA-NCA)开环聚合得到表面接枝聚天冬氨酸苄酯(PBLA)的羟基磷灰石(PBLA-g-HA),实现了HA表面由亲水性向疏水性的转变,合成结果通过红外光谱(FT-IR)与热重(TG)表征。FT-IR和TG结果均证实HA被成功接枝,通过控制不同的反应时间和比例,羟基磷灰石表面的PBLA接枝量为28.32%~60.48%。分散性实验证实经过PBLA表面改性的HA可显著地增加HA表面的疏水性和防止纳米粒子HA的聚集。