4,4’-二异硫氰基芪-2,2’-二磺酸对大鼠缺血再灌注损伤的影响及机制

目的探讨广谱氯离子通道阻滞剂4,4’-二异硫氰基芪2,2’-二磺酸(DIDS)对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响及其机制。方法雄性SD大鼠36只随机分为3组:缺血再灌注组(A组)、DIDS处理组(B组)和LY294002预处理组(C组)。伊文兰和TTC染色测定心肌梗死范围,TUNEL方法定性和定量检测心肌细胞凋亡指数,Western blot测定蛋白激酶B(Akt)的表达。结果与A组比较,B组心肌梗死范围和心肌细胞凋亡指数明显降低[(38.8±7.7)% vs (54.2±10.8)%,(8.9±1.8)% vs (17.6±3.5)%.P<0.01];磷酸化Akt表达水平明显增加(P<0.01)。与A组比较,C组梗死面积、凋亡指数无明显减小,磷酸化Akt水平无明显变化(P>0.05)。结论 DIDS能够抑制大鼠缺血再灌注所致的心肌细胞损伤,可能是通过信号分子磷脂酰肌酶三羟基激酶/Akt的调节。

DIDS对Bcl-2／Bax在staurosporine诱导心肌细胞凋亡中表达的影响

目的探讨氯离子通道阻断剂DIDS(4,4′-diisothiocy-ano-2,2′-stilbene-disulfonic acid)对staurosporine(STS)诱导心肌细胞凋亡的调节蛋白Bcl-2/Bax表达的影响。方法在STS诱导心肌细胞凋亡模型上,观察DIDS对心肌细胞存活率、caspase-3活性、Bcl-2/Bax蛋白表达水平及Bax细胞内分布的影响。实验分组:对照组、STS组、DIDS组。结果与STS组比较,DIDS能够明显抑制STS诱导的心肌细胞凋亡发生,心肌细胞存活率增加,caspase-3活性水平降低(P<0.01)。对照组、STS组和DIDS组在全细胞水平上Bcl-2、Bax表达差异无显著性(P>0.01),在亚细胞水平上发现STS组有明显的Bax蛋白从胞质向线粒体转位,DIDS可以抑制STS诱导的Bax线粒体转位。结论DIDS抑制心肌细胞凋亡可能与抑制促凋亡分子Bax由胞质向线粒体转位有关。

氯离子通道阻滞剂DIDS和NPPB对缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡保护作用的研究

目的探讨氯离子通道阻滞剂DIDS和NPPB对缺血再灌注(I/R)诱导心肌细胞凋亡过程中的保护作用及可能机制。方法在原代培养鼠心肌细胞I/R诱导心肌细胞凋亡模型中,将实验分为对照组、I/R组、DIDS组和NPPB组,每组20孔。观察心肌细胞的存活率、caspase-3活性及细胞膜完整性。结果I/R组心肌细胞存活率52.1%,DIDS组和NPPB组分别是84.5%和74.7%,均有统计学差异(P<0.01);细胞凋亡DNA电泳片断显示,DIDS组和NPPB组均能显著的抑制DNA的降解。再灌注24 h后,I/R组细胞内caspase-3活性水平482.3%,DIDS组和NPPB组分别是171.7%和211.8%,均有统计学差异(P<0.01)。各组乳酸脱氢酶水平均<5%。结论在I/R诱导的凋亡性心肌细胞损伤中,氯离子通道阻断滞剂能通过有效的抑制Caspase-3活性,起到保护心肌细胞的作用。

DIDS通过PI3-K/Akt途径减弱缺血/再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在DIDS(4,4′-diisothiocyanostilbene-2,2′-disulfonic acid)减弱缺血/再灌注损伤(I/RI)诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法以I/RI诱导心肌细胞凋亡,然后用PI3-K特异性的抑制剂LY294002[22(42吗啉基)282苯基24氢212苯并吡喃242酮]进行干预。实验分为正常对照组、I/RI组、I/RI+DIDS组和I/RI+DIDS+LY294002组。通过噻唑蓝(MTT)比色法、Hoechest-33258染色和半胱天冬蛋白酶(Apo-ONETMHomogeneous Caspase)-3试剂盒以及Western blot分别检测:心肌细胞的存活率(%)、细胞核的形态变化和caspase-3活性、Akt的磷酸化。结果①DIDS能够显著抑制I/RI诱导的细胞存活率的下降,抑制凋亡小体的出现,抑制caspase-3的活性的增加(P<0.01)。②用LY294002预处理后,DIDS保护I/RI心肌细胞存活的作用减弱、凋亡小体增加和caspase-3活性明显升高(P<0.01)。③I/RI组与正常对照组Akt磷酸化无明显差异,DIDS能够显著增加I/RI组中Akt蛋白的磷酸化(P<0.01)。用LY294002预处理后,DIDS对I/RI组Akt蛋白磷酸化的影响明显减弱(P<0.01)。结论DIDS可通过激活PI3-K/Akt信号通路减弱I/RI诱导的心肌细胞的凋亡。

模拟缺血/再灌注诱导小鼠心肌细胞凋亡模型的构建及其生化特征

目的建立稳定的缺血/再灌注(I/R)诱导小鼠心肌细胞凋亡模型并观察其生化特征。方法原代培养的小鼠心肌细胞在模拟I/R条件下,观察细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)水平,半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3水平、DNA-Ladder现象。结果①不同的缺血和再灌注时间,均能够造成心肌细胞的损伤,随着缺血时间的延长细胞损伤以坏死性死亡为主要方式,而再灌注损伤主要方式是细胞凋亡。②在缺血6h再灌注96h过程中发现:心肌细胞出现明显的皱缩、胞核染色质断裂、聚集、固缩等典型的凋亡形态学变化;I/R组的细胞存活率是52.2%,与正常对照组100%之间有显著性差异(n=20,P<0.01);在缺血期Caspase-3活性和LDH释放水平呈现线形增加,而活性氧(ROS)变化不大;在再灌注期Caspase-3活性和ROS于24h达峰值,96h后逐步恢复接近正常水平;LDH释放水平缓慢增加,96h后仅为3.5%。96h后可见明显的DNA-Ladder现象。结论模拟缺血6h和再灌注96h构建了稳定的小鼠心肌细胞凋亡模型,再灌注损伤是形成凋亡性死亡的主要因素。

DIDS对缺血/灌注损伤大鼠心脏血流动力学、心律失常和心肌酶活性的影响

目的观察4,4’-二异硫氰基芪-2,2’-二磺酸(4,4’-diisothiocyanostilbene-2,2’-disulfonic acid,DIDS)对在体大鼠缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injure,I/RI)心脏的心律失常、心肌酶活性和血流动力学的影响。方法雄性SD大鼠25只随机分为5组,每组5只:假手术组、I/R组、I/R+DIDS(7 mg/kg)组、I/R+DIDS(14 mg/kg)组及I/R+DIDS(28 mg/kg)组。于再灌注即刻,经股静脉以程控微量泵给予DIDS[4 ml/(kg.h)]2 h。于缺血前、后和再灌注后,记录心脏血流动力学指标、心电图变化,再灌注后测定各组血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。结果DIDS可改善缺血30 min/再灌注4 h,心脏的血流动力学指标,与假手术组相比,I/R组的左室舒张末期压(LVEDP)明显升高;而左室收缩压(LVSP)、左室内压上升的最大速率(+dp/dtmax)和左室内压下降的最大速率(-dp/dtmax)明显下降(P<0.05);降低心脏心律失常积分,再灌注期间,在假手术组、I/R组、I/R+DIDS(7 mg/kg)组、I/R+DIDS(14 mg/kg)组、I/R+DIDS(28 mg/kg)组的心律失常积分值,分别是1.20±0.45,4.57±1.62,3.97±1.51,3.23±1.13和3.56±1.47,表明DIDS可明显抑制再灌注期心律失常(P<0.05),尤以I/R+DIDS(14 mg/kg)组为显著(P<0.01);减少外周血CK和LDH的活性,与I/R组相比,DIDS组LDH和CK的活性明显降低(P<0.05)。结论DIDS具有保护I/RI的作用,减少再灌注后的心律失常、抑制心肌酶释放和改善心脏的功能。

Staurosporine诱导乳鼠心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax的关系

目的探讨staurosporine(STS)诱导心肌细胞凋亡过程中,凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化及意义。方法以STS诱导原代培养的SD乳鼠心肌细胞,检测半胱天冬蛋白酶(caspase)-3的活性及用Hoechst-33258荧光染色观察细胞凋亡。用免疫印迹法(Western blot)检测Bcl-2和Bax表达的变化。用免疫荧光共聚焦显微镜和免疫印迹法观察Bax在细胞内的分布。结果以4μmol/L STS处理心肌细胞,随着处理时间的延长,细胞中caspase-3的活性逐渐增加,与对照组比较,8 h达到峰值(P<0.01)。Hoechst-33258荧光染色显示,多数细胞核呈现核分叶。STS诱导心肌细胞凋亡过程中,Bcl-2和Bax的水平与对照组比较无显著变化。正常细胞内的Bax均匀分布于细胞质中,在STS处理的细胞中,Bax明显聚集于线粒体上,呈现明显的线粒体的转位。STS诱导心肌细胞凋亡过程中,胞质片段Bax的水平明显下降,而线粒体片段Bax的水平明显升高,进一步证实STS诱导细胞凋亡过程中伴有明显的Bax线粒体转位。结论STS诱导细胞凋亡中,伴有明显的Bax由胞质向线粒体的转位。

Cl^-/HCO_3^-交换器对星状孢子素诱导的小鼠心肌细胞凋亡的调节

目的:观察Cl-/HCO3-交换器是否参与了星状孢子素(STS)诱导的心肌细胞凋亡过程及其作用。方法:在建立的STS诱导原代培养的乳鼠心肌细胞凋亡模型上,通过使用Cl-通道阻断剂(NPPB)、Cl-通道阻断剂并Cl-/HCO3-交换器阻断剂(DIDS)或更换含或无HCO3-成分的培养基,观察Cl-/HCO3-交换器对STS诱导的心肌细胞凋亡的影响。结果:(1)在含HCO3-成分培养基中,DIDS和NPPB组在细胞存活率、caspase-3激活水平分别为59.7%和47.2%、175.0%和212.0%;两组比较具有显著差异(P<0.01,n=20)。在无HCO3-成分培养基中,DIDS与NPPB组在细胞存活率、caspase-3活性分别是62.1%与61.8%、176.5%与181.6%,两组比较无显著差异(P>0.05,n=20)。(2)STS阳性组中在含有与无HCO3-成分培养基中细胞存活率、caspase-3活性分别是29.8%与41.6%、553.4%与424.7%,两组相比有显著差异(P<0.01,n=20),但两组均可观察到DNA凋亡片段。结论:Cl-/HCO3-交换器通过氯交换参与了STS诱导的心肌细胞凋亡过程,并非是细胞凋亡过程中氯离子交换的主体。

DIDS对十字孢碱诱导心肌细胞凋亡中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号转导的影响

目的探讨氯离子通道阻断剂DIDS对十字孢碱诱导心肌细胞凋亡与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号及其下游分子一氧化氮合酶/一氧化氮的关系。方法实验分为对照组、十字孢碱组、DIDS组、LY294002(特异性磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)组和L-NAME(非特异性一氧化氮合酶抑制剂)组。在十字孢碱诱导心肌细胞凋亡模型上,观察DIDS对心肌细胞存活率、凋亡和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B及其下游分子一氧化氮合酶/一氧化氮的影响。结果与十字孢碱组比,DIDS明显改善了细胞存活率,提高了细胞磷酸化蛋白激酶B活性2.1倍(P<0.01),增加了一氧化氮合酶和磷酸化一氧化氮合酶的水平和一氧化氮水平(P<0.01);LY294002预处理完全抑制了磷酸化蛋白激酶B、一氧化氮合酶和磷酸化一氧化氮合酶水平的升高及升高的一氧化氮,完全阻断了DIDS的抗细胞凋亡作用;L-NAME预处理也使升高的一氧化氮水平下降,但仅部分阻断了DIDS的细胞保护作用。结论DIDS通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路发挥其抑制十字孢碱诱导的心肌细胞凋亡作用。

急性下肢缺血性疾病截肢术后的临床护理

目的探讨因急性下肢动脉缺血导致足趾坏死行截肢手术患者术后的临床护理方法。方法回顾性分析2015年1月—2016年1月蚌埠医学院第一附属医院血管外科收住的18例因急性下肢动脉缺血导致足趾坏死行截肢治疗患者术后的临床护理资料,护理上包括积极的心理疏导、残端创面的精心护理、饮食健康指导、康复训练等,一期愈合不良的创面经过一段时间清创待新鲜肉芽组织生长后行负压封闭引流1周,观察术肢残端愈合及患者恢复情况。结果本组12例患者术后残端创面一期愈合;5例患者术后创面发生脂肪液化,部分切缘不愈合,加强换药联合负压封闭引流术,二期缝合;3例患者术后出现肺部感染,4例患者术后出现心衰症状;经综合治疗与护理,17例患者残端伤口均愈合,肢体功能锻炼良好,肺部感染、心衰症状得到有效控制,餐后血糖均控制在9.0 mmol/L以下,1例高龄患者术后4 d发生心肺功能衰竭死亡。结论下肢缺血性疾病导致足趾坏死截肢术后需要配合安全、精心的护理与健康饮食指导,对促进患者康复、创面愈合、减少并发症、提高患者生活质量有着重要意义。

钾离子通道在心肌细胞缺血再灌注诱导凋亡过程中的作用机制

目的探讨钾离子通道在缺血再灌注（I／R）诱导心肌细胞凋亡过程中的作用。方法在原代培养鼠心肌细胞I／R损伤诱导心肌细胞凋亡模型中，观察钾离子通道阻断剂奎宁和氯化钡对心肌细胞的存活率、半胱天门冬氨酸酶（caspase）-3活性、活性氧的活性水平和细胞膜完整性的影响。实验分为4组：（1）阴性对照组；（2）I／R阳性对照组；（3）I／R奎宁干预组；（4）I／R氯化钡干预组。结果（1）钾离子通道阻断剂能有效抑制I／R诱导的心肌细胞凋亡，奎宁和氯化钡组细胞的成活率分别是81．1％和82．3％，与阳性对照组（52．1％）比较，差异有统计学意义（均为P〈0．01）；（2）钾离子通道阻断剂能有效的抑制caspase-3活性的激活，I／R 24h后细胞的caspase-3活性奎宁和氯化钡组分别是188．3％和191．4％，与阳性对照组（482．3％）比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；（3）钾离子通道阻断剂能有效的抑制活性氧产生，I／R24h后奎宁和氯化钡组在细胞内的相对活性氧活性水平分别是21．6和19．1，与阳性对照组61．4比较，活性氧活性水平降低（P〈0．01）；（4）细胞膜完整性实验乳酸脱氢酶水平显示，各组I／R96h后细胞坏死低于10．0％。结论在I／R诱导的心肌细胞凋亡模型中，钾离子通道阻断剂通过抑制caspase-3活性、活性氧产生介导保护心肌细胞凋亡的发生。