流式细胞术在急性白血病免疫分型中的应用探讨

目的应用多参数流式细胞术检测急性白血病细胞表面CD抗原分子的表达水平,探讨AML和ALL中CD抗原的表达规律,为临床个体化治疗累积分子机制研究材料。方法应用流式细胞术检测44例急性髓细胞白血病患者和18例急性淋巴细胞白血病患者,以CD45/SSC设门,应用13种单克隆抗体对CD45弱表达的细胞群进行免疫分型,测定多种CD分子的表达率,并通过χ~2检验比较不同的高表达CD分子的相关性。结果 44例AML患者中表达且高表达CD33(79.6%),CD38(70.5%),CD117(52.3%),cyt-MPO(50.0%);16例B-ALL患者中CD10(75.0%),CD19(81.25%)以及CD22(81.25%)阳性表达率较高;比较AML患者高表达CD抗原,结果显示CD33/CD38、CD33/cyt-MPO的抗原表达差异均有统计学意义(P<0.05)。结论不同的CD分子在急性白血病细胞上表达有差异性,或将为靶向治疗和临床个体化治疗提供有用的线索。

免疫球蛋白A抗体作为治疗性药物的现状与前景

在过去40年里,单克隆抗体作为治疗性生物制品已在肿瘤学、血液学、自身免疫性疾病以及感染性疾病中发挥了重大作用。目前上市的治疗性单克隆抗体基本是免疫球蛋白G(IgG)类抗体,而近年来人们发现免疫球蛋白A(IgA)似乎也能发挥等同的作用,其独特的结构和体内分布、介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)时招募不同于IgG的效应细胞以及参与免疫系统调节都表明了IgA抗体有望成为新型治疗性抗体。本文就IgA的生物学特性、在疾病中的应用以及作为治疗性抗体现阶段存在的一些技术限制进行综述。

抗猴痘病毒A35R蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的制备抗猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)A35R蛋白单克隆抗体并建立其双抗体夹心ELISA检测方法,同时对方法进行验证。方法原核表达MPXV A35R蛋白并免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术制备抗A35R蛋白单克隆抗体,对单克隆抗体的特异性、结合活性进行鉴定;建立双抗体夹心ELISA检测方法,对该方法的线性范围、检测限、专属性、准确性、精密度进行验证。结果制备了7株抗MPXV A35R单克隆抗体。Western blot鉴定结果显示,7株单克隆抗体均与MPXV A35R蛋白及灭活MPXV发生特异性反应;7株单克隆抗体结合活性为11.35~27.73 ng/mL;抗体经配对筛选后,确定以7G5和2F5为最佳配对抗体,用于建立双抗体夹心ELISA方法。该方法对灭活MPXV抗原最低检测限为1.250×10~4 TCID50/mL,对MPXV A35R蛋白最低检测限为1.95 ng/mL,线性范围为3.91~125.00 ng/mL,线性回归方程为y=1.7320x-0.9208,R2=0.9843;该方法专属性较强且不与其他病毒及蛋白发生交叉反应;准确性验证结果显示,病毒抗原回收率为96.94%~110.04%;批间CV为0.26%~8.13%,批内CV为2.10%~5.48%。结论成功制备了抗MPXV A35R蛋白单克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测方法。验证结果显示,该方法具有较高的灵敏度、准确度、重复性及专属性,可用于以A35R蛋白为基础的猴痘亚单位疫苗的生产质量控制。

猴痘病毒特异性胶体金免疫层析检测法的建立及验证

目的建立快速检测猴痘病毒(monkeypox virus, MPXV)的胶体金免疫层析检测方法, 并对该方法进行验证。方法采用NaCl沉淀实验优化7株抗MPXV A35R单克隆抗体(单抗)的标记条件, 采用抗体配对实验确定金标抗体与捕获抗体, 并优化抗体检测线(T线)及质控线(C线)的点样浓度, 建立胶体金免疫层析检测方法。对该方法的特异性、检测限、稳定性、重复性、钩状效应和抗干扰性进行检测。结果 7株抗MPXV A35R单抗8D7、10D2、2F5、10G4、7G5、10E4、2D7的最适抗体标记量分别为0.96、0.48、0.96、0.96、0.96、0.96、0.48 μl, 金标抗体2D7和检测抗体8D7组合为最佳配对抗体;T线和C线点样的最佳浓度分别为1.00和0.50 mg/ml。胶体金试纸条可检测出MPXV, 而检测不出其他病毒;MPXV A35R蛋白和灭活MPXV溶液的最低检测限度分别为2.34×10^(-5) mg/ml和1.00×10^(5) TCID50/ml;阴性样本和阳性样本的显色情况一致;20份试纸条检测样本的显色情况一致;检测MPXV A35R蛋白和灭活MPXV溶液的浓度与显色程度成正比;试纸条不受干扰物的干扰。结论成功建立了快速检测MPXV的胶体金免疫层析检测方法, 该方法具有良好的特异性、检测范围、稳定性、重复性和抗干扰性, 且不存在钩状效应。

重组抗SARS-CoV-2 IgA单克隆抗体的优化表达及其初步鉴定

目的制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)IgA单克隆抗体,对其表达条件进行优化以提高表达量,并初步探讨IgA抗体在抗SARS-CoV-2中的效应。方法将编码IgA1-F61抗体序列的质粒与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)转染试剂混合后转染EXPi293F^(TM)细胞,瞬时表达抗体蛋白;通过优化重链(heavy chain,Hc)、轻链(light chain,Lc)、J链(joining chain,Jc)比例、质粒与PEI比例、转染后收获时间确定单体IgA1(monomeric IgA1,mIgA1)-F61及二聚体IgA1(dimeric IgA1,dIgA1)-F61在EXPi293F^(TM)细胞中的最佳培养条件以及最佳表达量。将转染后上清经亲和层析纯化后,BCA法测定浓度,SDS-PAGE及体积排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法分析抗体表达完整性及纯度,假病毒中和试验检测抗体中和活性。结果当He与Lc比例为1:2、质粒与PEI比例为1:3、转染后5d收获上清时,mIgA1-F61最高表达量为123.45μg/mL,纯化后抗体纯度达95%以上;Hc:Lc:Jc为1:2:1时,可获得最大纯度的dIgA1-F61,达90%以上。针对OmicronBA.4/5的假病毒中和试验结果显示,dIgA1-F61呈现优于IgG-F61的中和活性,其最大半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))降低了4倍左右。结论成功表达了重组抗SARS-CoV-2单克隆抗体mIgA1-F61和dIgA1-F61,纯度较高,且dIgA1在体外展现出优于IgG的中和活性。