Sirt1参与异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大

目的:观察Ⅲ类组蛋白去乙酰基酶1(Sirt1)在异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥大中的表达及作用。方法:昆明小鼠随机分为正常对照组、ISO模型组和ISO+NAM(烟酰胺,Sirt1抑制剂)组。皮下注射ISO诱导小鼠心肌肥大。以心脏重量指数(心脏重量/体重)、HE染色、透射电镜以及脑钠肽(BNP)mRNA表达水平观察心肌肥大的变化。同时采用RT-PCR、Western blotting检测各组心肌Sirt1 mRNA、蛋白质的表达。结果:与对照组相比,心脏重量指数,HE染色,透射电镜以及BNP mRNA表达水平均显示皮下注射ISO可明显诱导小鼠心肌肥大;Sirt1在心肌肥大模型组表达显著增多(P<0.01),其抑制剂NAM可明显减轻ISO诱导的心肌肥大(P<0.05),并降低Sirt1的表达(P<0.01)。结论:Sirt1的激活可能参与ISO诱导的小鼠心肌肥大。

钙敏感受体对人单核巨噬细胞株THP-1细胞因子分泌功能的影响

目的探讨钙敏感受体（Calcium sensing receptor，CaSR）对THP-1源性巨噬细胞分泌细胞因子能力的影响。方法首先将人单核细胞株THP-1用佛波脂（PMA，100nmol／L）诱导，使之转化为具有贴壁能力的巨噬细胞株THP-1（以下简称THP-1）。用CaSR特异激动剂氯化钆（GdCl3，1retool／L）处理细胞后，用ELISA法检测CaSR的激活对THP-1分泌细胞因子IL-1β、TNFα的影响，并利用Western Blotting方法检测NF—κB信号通路中p65、p50和IKBct蛋白的表达变化。结果（1）用GdCl，处理后，THP-1细胞上清液中IL-1β、TNF—α的含量明显升高，但该作用可被CaSR特异抑制剂NPS2390（10μmol／L）抑制；（2）在Gd3＋作用组，THP-1细胞中NF—μB—p65表达明显上调，同时伴有IKBet的减少；在NPS2390预处理组，Gd3＋所引起的NF—κB—p65和IκBα变化被抑制；各组NF—κB—p50变化不明显。结论CaSR的激活可能通过激活NF—κB信号通路促进THP-1源性巨噬细胞株分泌细胞因子IL-1β、TNF—α，提示CaSR可能参与涉及单核巨噬细胞激活的各种疾病。

阴离子交换蛋白1与P16蛋白在HeLa细胞中共表达

目的在人宫颈癌细胞株(HeLa)中共表达具有阴离子转运活性的阴离子交换蛋白(anion exchanger 1,AE1)与P16蛋白,观察两者之间的相互作用。方法用脂质体将目的基因转入HeLa,Western blot及免疫荧光方法验证蛋白表达及定位,描绘细胞生长曲线,运用6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉铵(SPQ)测定细胞阴离子转运活性。结果 P16和AE1均成功在HeLa细胞中过表达。共同转染pEGFP-C1-p16和pRBG4-AE1后HeLa细胞的阴离子交换功能明显增强,且细胞增殖能力明显下降。结论 P16与AE1之间存在相互作用和/或协同作用,为进一步研究AE1在细胞增殖和肿瘤发生、发展过程中作用奠定了基础。

阴离子交换蛋白1在HEK293t细胞中的高效表达与鉴定

目的 在人胚肾HEK2 93t(2 93t)细胞高效表达具有阴离子转运活性的阴离子交换蛋白1(AE1)。方法 用传统磷酸钙转染法将质粒pRBG4- AE1转入2 93t细胞,免疫荧光及Westernblotting验证蛋白表达及正常的细胞膜定位后,应用6 - 甲氧基- N- (3- 磺丙基)喹啉铵(SPQ)观察表达的AE1是否具有阴离子转运活性。结果 在2 93t细胞中,显示AE1高效表达。转染pRBG4 - AE1后2 93t细胞相对于正常以及转染空载体对照组的阴离子交换功能明显增强。结论 利用传统磷酸钙转染法,在2 93t可高效表达具有正常跨膜拓扑结构及阴离子转运活性的AE1,为进一步研究其相关功能奠定了基础。

病理生理学教学中的几点体会

病理生理学一直被学生认为是一门较难掌握的学科.青年教师在病理生理学的教学工作中,更应该顺应社会需要,提高自己的道德素质,完善自己的知识结构,更新观念,成为一名知识水平、人格魅力、职业道德都经得住考验的优秀教师.

多胺在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的作用及意义

目的:研究多胺、鸟氨酸脱羧酶(ODC)及精脒/精胺乙酰基转移酶(SSAT)在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的作用及机制。方法:异丙肾上腺素(ISO)皮下注射复制大鼠心肌肥厚模型,应用反向高效液相色谱(RP-HPLC)、RT-PCR和Western blotting结合图像分析系统,分别检测ISO作用不同时点大鼠心肌组织多胺含量、ODC和SSAT mRNA和蛋白的表达。结果:与对照组比较,心脏重量参数在ISO注射后7d时显著增加,ISO注射后1d时腐胺含量增加(P<0.05),5d、7d时显著增加(P<0.01);精脒含量在ISO注射后3d时开始增加,ISO注射后7d时增加显著(P<0.01),精胺含量略有增多(P<0.05),总多胺池显著增加。心肌组织ODC和SSAT的mRNA表达在ISO注射后1d时升高(P<0.05或P<0.01),并持续在较高水平。心肌组织ODC和SSAT的蛋白表达分别在ISO注射后1d和ISO注射后5d时升高,ISO注射后7d时显著升高(P<0.01)。结论:大鼠心肌组织多胺含量增加和ODC、SSAT的表达增强可能参与ISO所致心肌肥厚的病理过程。

p16蛋白过表达对哺乳动物细胞带3蛋白阴离子交换功能的影响

目的 :研究p16过表达对HeLa细胞带 3蛋白 (band 3)阴离子交换功能的影响。方法 :细胞免疫组织化学法检测HeLa细胞中p16和带 3蛋白的表达。采用PCR方法将p16cDNA亚克隆到pEGFP -C1上 ,经双酶切和DNA测序鉴定后将其转染HeLa细胞 ,在荧光显微镜下观察细胞转染效率。应用 6甲基 - 3-磺丙基 - 1-喹啉 -水化合物 (SPQ)荧光探针检测带 3蛋白的阴离子交换功能。结果 :在HeLa细胞中p16和带 3蛋白表达均为阳性。双酶切和DNA测序结果证明所扩增的p16cDNA序列与报道序列相同。细胞转染后在荧光显微镜下可观察到 6 0 %以上的细胞发出荧光。转染pEGFP -C1-p16后细胞的阴离子交换功能增强。结论 :p16对HeLa细胞带 3蛋白的阴离子交换功能有促进作用。

恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白表达及其对K562细胞生长的影响

背景与目的:带3蛋白介导Cl-/H CO3-的跨膜交换,从而调节细胞内pH值。有学者证实,Cl-/H CO3-交换的异常可引起细胞内pH值明显改变,使细胞发生增殖或凋亡。本研究旨在探讨红细胞膜带3蛋白的表达及其对K562细胞生长的影响。方法:以SPQ为荧光探针测定8例恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白的阴离子转运活性,W estern blot检测带3蛋白表达。转染带3蛋白膜段结构域cDNA至K562细胞,观察带3蛋白膜段结构域表达后对K562细胞阴离子转运活性及细胞增殖的影响。结果:7例恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白的离子转运活性明显增强,5例蛋白质表达增强。同时发现带3蛋白膜段结构域表达于K562细胞膜后,对K562细胞生长有一定促进作用。结论:带3蛋白在部分恶性肿瘤患者红细胞膜表达增强,可作为恶性肿瘤的一种潜在标志物。

多胺在L-精氨酸抑制异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚中的作用

目的:研究多胺在L-精氨酸抑制病理性心肌肥厚中的作用及机制。方法:异丙肾上腺素(ISO)皮下注射复制大鼠心肌肥厚模型,L-精氨酸作为干预因素,检测心脏肥大指数,心肌组织胶原染色,心房利钠肽(ANP)的转录水平,观察L-精氨酸对心肌肥大的影响;不同时段,应用高效液相色谱仪(HPLC)测定心肌组织内多胺含量,应用Western blotting结合图像分析系统,检测各组大鼠心肌组织鸟氨酸脱羧酶(ODC)和精眯/精胺乙酰转移酶(SSAT)的蛋白表达水平;检测血清NO含量和NOS活性。结果:皮下注射ISO7d后,心肌肥大指数增加,心肌纤维增粗、排列紊乱,ANP mRNA表达增加;L-精氨酸干预可抑制ISO诱导的心肌肥大,随着L-精氨酸作用时间延长,心肌组织多胺含量减少,血清NOS活性增强,NO含量增加。同时,ODC蛋白表达下调,SSAT蛋白表达上调。结论:L-精氨酸抑制ISO诱导的心肌肥大,其机制可能与下调L-精氨酸/多胺通路、上调L-精氨酸/NO通路有关。

卡马西平对雌激素依赖性乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制的研究

背景与目的:卡马西平是一种应用多年的抗癫痫药,最近研究证明其具有组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDI)的性质。而已知的HDI多具有抗肿瘤作用。本实验旨在探讨卡马西平对雌激素受体!(estrogenreceptorα,ERα)阳性乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法:利用磺酰罗丹明B色度法(sulforhodamineB,SRB)分析不同情况下卡马西平对细胞增殖的影响。Westernblot法检测ERα、CyclinD1等相关蛋白的表达水平;RT-PCR法检测相应mRNA水平的变化;免疫荧光法测定他莫昔芬耐药细胞MCF-7RT中HER-2的表达;免疫沉淀技术检测Hsp90的分子伴侣功能及乙酰化水平。结果:卡马西平处理ERα阳性细胞MCF-7及T47D时,显著抑制雌二醇刺激的细胞增殖效应(P<0.01);卡马西平与4羟基他莫昔芬(4-OHT)联合处理MCF-7细胞,对雌二醇引起的细胞增殖抑制呈相加作用(q=1.00);在MCF-7RT细胞中,卡马西平逆转了4-OHT的刺激增殖作用(P<0.01);卡马西平处理可以降低ERα阳性细胞中ERα、CyclinD1在蛋白及mRNA水平的表达,并降低MCF-7RT细胞中HER-2表达;ERα、CyclinD1的表达降低可以被26s蛋白酶体抑制剂MG132抑制;卡马西平可以促进Hsp90乙酰化并破坏其分子伴侣功能。结论:卡马西平明显抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖,该作用可能部分通过促进ERα、CyclinD1的蛋白酶体降解途径实现。卡马西平可以通过降低HER-2表达逆转与HER-2相关的4-OHT耐药。

miR-580对乳腺癌细胞系中Twist1的调节作用

目的:探讨miR-580在MCF-10A细胞系中对于Twistl的调节。方法:本实验利用生物信息学方法预测Twistl的靶miRNA是miR-580。首先,采用qPCR法检测在MCF-10A系列细胞系中Twist1及miR-580的表达。然后,在MCF-10A细胞系中分别转染miR-580类似物和miR-580抑制物后,利用RT-PCR、Western blot、t检验分析Twistl的表达及细胞迁移能力的变化。最后利用荧光素酶实验验证miR-580通过结合在Twistl的3'UTR调节其表达。结果:1)在MCF-10A细胞系中Twist1与miR-580的表达呈负相关;2)在MCF-10A细胞系中转染miR-580类似物后,Twist1的表达下调;在MCF-10A细胞系中转染miR-580抑制物后Twistl的表达上调;3)在MCF-10A细胞系中引人miR-580类似物后细胞迁移能力降低;4)miR-580直接结合在Twistl的3'UTR。结论:miRNA-580在MCF-10A细胞系中通过结合在Twistl的3'UTR负向调节Twist1的表达从而克制细胞的迁移。

氯化钆抑制肿瘤细胞迁移侵袭的作用研究

目的探讨氯化钆对肺腺癌细胞株(A549)迁移侵袭能力的影响,以期能够为肿瘤治疗寻找新的线索.方法用氯化钆联合转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)处理的A549细胞,Transwell小室实验检测A549迁移侵袭能力;实时定量PCR检测相关蛋白的mRNA的转录水平.结果 Transwell小室迁移实验结果显示GdCl3能够降低A549细胞的迁移能力(P<0.05);Transwell小室侵袭实验显示氯化钆处理后,A549细胞侵袭能力减弱(P<0.05);实时定量PCR结果显示N-钙粘蛋白,波形蛋白mRNA减少;E-钙粘蛋白mRNA增加(P值均<0.05).结论氯化钆可起到抑制肿瘤细胞迁移侵袭的作用.通过对氯化钆药理作用的深入研究,可为肿瘤提供新的治疗途径.

抑制钙敏感受体表达对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌H9c2细胞肥大的影响

目的 探讨抑制钙敏感受体（CaSR）表达对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导大鼠心肌H9c2细胞肥大的影响及作用机制.方法 采用细胞培养的方法,用AngⅡ处理H9c2细胞复制心肌肥大细胞模型,并在此基础上,应用CaSR激动剂三氯化钆（GdCl3）、CaSR抑制剂Calhex231或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞.共分为5组：对照组、AngⅡ组、GdCl3＋ AngⅡ组、GdCl3＋ Calhex231＋ AngⅡ组、GdCl3＋ 3-MA＋ AngⅡ组,每组6例.采用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定总蛋白含量;蛋白印迹法检测心肌肥大信号蛋白Ca2＋/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKⅡ）与其磷酸化形式（pCaMKⅡ）表达来评价细胞肥大情况;蛋白印迹法检测CaSR、自噬标志物[Beclin-1、微管相关蛋白轻链（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ、P62]和Ca2＋/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）-腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的表达.结果 ①GdCl3能够促进AngⅡ所诱发的CaSR蛋白表达增多（对照组：0.22±0.04; AngⅡ组：0.43±0.02; GdCl3＋ AngⅡ组：0.63±0.08,P均＜0.05）、细胞总蛋白含量增多[对照组：（2.52±0.84）g/L;AngⅡ组：（8.72±3.60）g/L;GdCl3＋ AngⅡ组：（14.17±4.49）g/L,P均＜0.05]、pCaMKⅡ/CaMKⅡ比值升高（对照组：0.25±0.05; AngⅡ组：0.51±0.03;GdCl3＋ AngⅡ组：0.77±0.06,P均＜0.05）,而Calhex231则能够抑制GdCl3引起的上述指标的增加[GdCl3＋Calhex231＋AngⅡ组,CaSR：0.41±0.16;总蛋白含量：（9.92±2.54） g/L;pCaMK Ⅱ/CaMK Ⅱ：0.58±0.08,P均＜0.05].②GdCl3能够促进AngⅡ所诱发的自噬标志物Beclin-1蛋白表达增多（对照组：0.31±0.06; AngⅡ组：0.55±0.09;GdCl3＋AngⅡ组：0.74±0.08,P均＜0.05）、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值增加（对照组：0.28±0.06;AngⅡ组：0.56±0.10;GdCl3＋AngⅡ组：1.00±0.15,P均＜0.05）,P62蛋白表达减少（对照组：0.54±0.03;AngⅡ组：0.34±0.02; GdCl3＋ AngⅡ组：0.15±0.03,P均＜0.05）;Calhex231则能抑制GdCl3引起的自噬标志物指标的改变（GdCl3＋Calhex231＋AngⅡ组,Beclin-1：0.53±0.14;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ：0.57±0.12;P62：0.28±0.05,P均＜ 0.05）.③GdCl3可引起pCaMKKβ/CaMKKβ（对照组：0.43±0.09;AngⅡ组：0.76±0.12;GdCl3＋ AngⅡ组：1.19±0.21）和pAMPK/AMPK（对照组：0.38±0.11;AngⅡ组：0.68±0.08;GdCl3＋ AngⅡ组：1.18±0.08,P均＜0.05）比值升高,pmTOR/mTOR（对照组：0.90±0.10;AngⅡ组：0.54±0.04;GdCl3＋AngⅡ组：0.29±0.09,P均＜ 0.05）比值降低;Calhex231则能抑制GdCl3引起的上述蛋白表达变化（GdCl3＋ Calhex231＋AngⅡ组,pCaMKKβ/CaMKKβ：0.75±0.06;pAMPK/AMPK：0.57±0.05;pmTOR/mTOR：0.51±0.08,P均＜0.05）.结论 抑制CaSR表达可逆转AngⅡ诱导的H9c2细胞肥大,其机制可能与抑制自噬、抑制CaMKKβ-AMPK-mTOR通路有关.

卡马西平促进乳腺癌SKBR-3细胞中人表皮生长因子受体-2的降解

目的探讨卡马西平对乳腺癌细胞SKBR-3中人表皮生长因子受体-2(HER-2)表达的影响及其机制。方法分别用卡马西平、赫赛汀、17烯丙胺-17脱甲氧格尔德霉素(17-AAG)处理乳腺癌细胞SKBR-3,通过Western blot检测HER-2蛋白的表达;通过RT-PCR检测HER-2 mRNA的表达;通过免疫沉淀检测热休克蛋白90(HSP90)的分子伴侣功能及乙酰化水平;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果10μmol／L卡马西平处理即可降低乳腺癌细胞SKBR-3中HER-2蛋白水平,100μmoL／L卡马西平则在蛋白和mRNA水平均抑制HER-2的表达。卡马西平处理可以使HSP90乙酰化水平升高,并且破坏HSP90的分子伴侣功能。卡马西平对赫赛汀的促HER-2降解作用有协同作用。100μmol/L卡马西平+290μg/ml赫赛汀处理组、100μmol／L卡马西平+1μmol／L 17-AAG处理组的细胞增殖率分别为27．8％±3．0％和26．9％±2．8％,分别明显低于单独赫赛汀或17-AAG处理组(P均<0．01)。结论卡马西平可能通过破坏HSP90的分子伴侣功能、提高HSP90的乙酰化水平,降低了乳腺癌细胞SKBR-3中HER-2的表达水平,并且与赫赛汀和17-AAG有协同作用。卡马西平在肿瘤治疗中有潜在的应用价值。

葡萄籽原花青素调节MAPK对H_2O_2诱导的人晶状体上皮细胞的保护作用

目的探讨葡萄籽原花青素对H_2O_2导致的人晶状体上皮细胞损伤的保护作用的机制。方法对人晶状体上皮细胞进行培养,分别加入设计浓度的原花青素培养液,经过相应的培养时间后,再与含有不同浓度过氧化氢的培养液共同作用。流式细胞仪检测葡萄籽原花青素对细胞内活性氧的影响。用Western blot方法检测各组细胞中p38,p-p38,JNK,p-JNK蛋白的变化。结果在体外HLE-B3细胞培养状态下,葡萄籽原花青素能有效地降低细胞内活性氧水平。蛋白测定表明,p-p38,p-JNK蛋白表达下降。结论葡萄籽原花青素能够有效抑制p-p38,p-JNK蛋白表达,阻断了MAPK细胞信号传导通路,减少氧化氢诱导的氧化损伤的发生,从而对人晶状体上皮细胞具有保护作用。

自噬在肿瘤顺铂耐药中的作用

肿瘤是现社会致死率最高的疾病之一，化疗仍是其最广泛且有效的治疗手段，顺铂作为一种细胞毒药物被应用于临床恶性肿瘤的化疗，但是几乎所有的化疗最终会因耐药而导致治疗失败。自噬是一种精细调节的通路，主要是指胞浆中细胞器或其他组分经自噬溶酶体降解的过程。自噬与多种疾病有着紧密的联系。众多的研究证明，癌细胞接受化疗意味着自噬的激活，而自噬对肿瘤细胞的保护机制介导了肿瘤耐药的发生，但自噬在肿瘤的顺铂耐药中的机制仍待阐明。因此进一步研究自噬在肿瘤顺铂耐药中的机制以及寻找新的逆转耐药靶点是科研界面临的主要问题。

SNARE蛋白在肿瘤发生发展中的研究进展

可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors,SNAREs)是一组高度保守的膜相关蛋白,参与突触神经末梢的物质运输、膜融合和囊泡释放。近年研究表明,SNARE可以通过多种信号和转运途径参与肿瘤发生、发展等过程,包括细胞周期、自噬、凋亡、侵袭性伪足的形成、自分泌及旁分泌因子的运输、以及肿瘤免疫和化疗耐药等。敲除或过表达特定SNARE蛋白会导致细胞功能异常进而影响肿瘤的发生和发展。文章就SNARE蛋白的结构功能以及在肿瘤研究中的进展进行了综述。