绵羊皮肤中GHR、IGF-1和IGF-1R基因表达的发育性变化及品种特点

采用相对定量反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）方法，以18S rRNA作内标，研究了罗米丽（Romilly Hillys）×中国美利奴（新疆军垦型）杂交一代优质细毛羊和哈萨克粗毛羊皮肤中生长激素受体（GHR）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）和胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）mRNA发育性变化并进行了品种间比较。分别于30、60、90、135、180和255日龄称重、采毛样，并于30、90、135和255日龄采皮样。结果表明：粗毛羊和细毛羊体重、羊毛生长的发育模式没有明显的差异，30-135日龄体重迅速增加，135～255日龄增重十分缓慢；30-135日龄羊毛日增长逐渐增加，135-180日龄羊毛生长十分缓慢，而180-255日龄又上升到较高水平。粗毛羊皮肤中GHRmRNA在30～90曰龄显著增加（P〈0．05），90日龄达到高峰，此后显著下降（P〈0．05）；细毛羊在135日龄时GHR mRNA极显著地升高（P〈0．01），此后又极显著地下降。粗毛羊皮肤中IGF-1、IGF-1R mRNA30—90日龄上升，90日龄之后极显著下降（P〈0．01）：细毛羊皮肤中IGF—1、IGF-1R mRNA出生时较高，然后逐渐下降。品种之间比较，细毛羊GHR mRNA出现高峰晚于粗毛羊，135日龄高峰时显著地高于粗毛羊；粗毛羊IGF—1、IGF-1RmRNA在90日龄出现高峰，并极显著或显著地高于细毛羊；粗毛羊90日龄前GHR、IGF-1和IGF-1RmRNA高于细毛羊，之后低于细毛羊。结果提示：绵羊皮肤中GHR，IGF-1和IGF-1R基因表达有特定的发育模式，并存在品种差异。

基于转录组测序的哈萨克绵羊感染包虫病后小肠组织新转录本预测及分析

前期研究发现具有MHC-DRB1基因单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-HinlⅠab的哈萨克绵羊对包虫病具有很强的抵抗能力,但具体机制尚不明确,推测可能与可变剪切形成的小肠组织新转录本具有密切关系,因此,本研究采用PCR-RFLP方法从290只哈萨克绵羊中选择抗病和非抗病个体,分为抗性组(A租)、非抗性组(B组)和空白对照组(C组)。其中A组和B组人工感染包虫病一定时间后,与C组同时宰杀,分别取小肠组织进行Illumina转录组测序,测序结果通过荧光实时定量实验验证后,利用生物信息学方法对各组的新转录本进行预测和分析。结果显示:qRT-PCR验证实验表明转录组测序结果可信度较高,通过生物信息学方法分别从A、B和C组样本中预测出1393、1260、1097个,共计3750个新转录本。转录本所含外显子数与其生物功能多样性具有密切联系,研究发现3个组样品中含有2个以上外显子的新转录本占34.64%(1299个)。研究发现哈萨克绵羊感染包虫病后小肠组织新转录本显著增多,与C组相比A组和B组分别增加了26.98%和14.86%。KEGG Pathway富集分析结果表明,新转录本所对应的差异表达基因被富集到了自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路、细胞色素C-P450介导的外源性化学物质代谢途径和视黄醇代谢途径等代谢通路上。结论:研究发现哈萨克绵羊感染包虫病后,不同MHC-DBR1基因型个体的小肠组织中存在大量新转录本,可能与个体抗病性存在相关性。本研究为探讨哈萨克绵羊分子抗病机制和挖掘遗传育种标记提供了新的思路和理论依据。

塔里木马鹿微卫星遗传多样性与产茸量的相关性研究

利用7个微卫星遗传标记,采用PCR扩增,12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、Sanguinetti银染法显色,对新疆塔里木马鹿亚种遗传多样性进行检测,统计各群体的等位基因组成、平均有效等位基因数(E)和平均基因纯合率(Rh),根据等位基因频率计算出各群体的平均遗传杂合度(h)、多态信息含量(PIC)和群体间的遗传距离,利用分子进化遗传分析软件(MEGA),采用邻结法(NJ)重建系统发生树。根据等位基因频率,利用PHYLIP(3.6)分析软件,采用最大似然法(ML)构建系统发生树,应用自举检验(bootstrap test)估计系统树中节点的自引导值(bootstrap value),并进行了系统发生分析。同时对部分马鹿群体个体基因型与产茸量之间进行了相关分析。结果表明:7个微卫星位点在3个塔里木马鹿中的多态信息含量除BMS2508和Celjp0023没有多态性,以及BM5004为中度多态外,其他4个微卫星均为高度多态,可作为有效的遗传标记用于3个塔里木马鹿群体遗传多样性和系统发生关系的分析。所有马鹿群体的平均PIC为(0.5196)、h(0.5552)和E(2.45),其基因多态性和遗传多样性相对丰富。塔里木马鹿35团群体与沙雅群体的血缘关系及遗传距离近于阿拉尔群体,3个塔里木马鹿群体的系统发育关系基本符合其地理分布和育成史。微卫星位点BM4208的166bp/185bp基因型和微卫星BM888的208bp/208bp基因型可以对塔里木马鹿35团群体高产茸量进行分子遗传标记。

甘草酸单克隆抗体的制备及竞争ELISA法的建立

目前针对甘草酸的检测方法存在成本高、效率低的缺点,本研究通过碳二亚胺法合成甘草酸免疫原并制备出高效价高灵敏度的单克隆抗体,以建立一种基于间接竞争法的酶联免疫检测技术。本研究对常见甘草类型进行甘草酸含量测定并用HPLC法验证。结果表明:抗体效价>5×104,纯化抗体的蛋白浓度为10.03 mg/m L。竞争ELISA法的最小检测极限为1.62 ng/m L,检测范围为1.62-200 ng/m L。ELISA方法测定的数据与HPLC方法测定的数据有很好的相关性。该方法具有简单快速,效率高,成本低的特点,对甘草酸的含量测定有重要意义。

Zfy干扰基因对荷斯坦牛性别控制的效果

为了控制犊牛的性别,提高母犊率,通过生物技术方法,运用Zfy干扰基因载体对荷斯坦种公牛睾丸进行连续处理后,采集其精液制成性控冻精。通过小规模试验和大群中试应用,情期受胎率分别达到72.2%、65.4%,母犊率分别达到76.9%、71.6%,与普通冻精比较,母犊率分别高出29个百分点和23.7个百分点。后裔13月龄测试,其体重、胸围、体斜长等与普通冻精后裔基本一致(P>0.05)。说明这种性别控制的方法可行。

猪Zfy基因干扰载体的构建及性控效果的验证

为了探究Zfy基因在性别控制中的作用,试验运用RNAi技术,设计并合成了2对靶向猪Zfy基因的shRNA序列,构建了重组质粒(shRNA-a,shRNA-b),将其转染到体外培养的猪生精细胞中,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测生精细胞中Zfy基因mRNA的表达,然后选取4头健康公猪进行体内干扰试验,分为A组和B组,每组2头,将重组质粒注射到猪睾丸中,A组注射shRNA-a,B组注射shRNA-b,对照组为试验猪场不进行注射的公猪,观察子一代性别比例。结果显示,qRT-PCR检测shRNA-a和shRNA-b对生精细胞中Zfy基因的抑制效率分别为33%(P<0.05)和89%(P<0.005)。体内干扰试验中,对照组子一代仔猪雌性率为56.16%,A组、B组子一代仔猪雌性率分别为34.87%(P<0.005)和47.22%(P>0.05)。本试验成功构建干扰猪Zfy基因的重组质粒,并应用于动物试验,证实Zfy基因可以影响后代的性别比例,在动物性别控制中发挥一定的作用,但导致体内干扰试验结果与预期结果相反的原因仍需进一步验证。

高效siRNA的设计分析

RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默已成为基因功能分析的高效工具,设计出高效的siRNA是RNA干扰(RNAi)成功的关键,但现有的siRNA设计规则存在许多不一致性,使得高效siRNA设计困难重重。为了对这些设计规则进行进一步的验证并探讨不同设计规则在高效siRNA设计中的价值,研究设计了9条靶向zfy基因(zfy-1、zfy-2、zfy-3、zfy-4、zfy-5、zfy-6、zfy-7、zfy-8、zfy-9)和4条靶向zfx基因(zfx-1、zfx-2、zfx-3、zfx-4)的siRNA并构建了重组载体,转染28~32日龄仔猪睾丸组织分离的猪生精细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测zfy和zfx基因mRNA的表达。结果表明:每个siRNA对靶基因的下调水平不同,zfy-9的沉默效率最高,为89%,zfy-1、zfy-2、zfy-3、zfx-1对靶基因的表达没有沉默作用。通过对13个siRNA序列特征进行分析表明,在siRNA设计中符合越多的碱基偏好性准则,沉默效率越好;但是不同的准则重要性不同,siRNA反义链中第10位的U和第13位的A/U对高效siRNA设计更有作用,应优先考虑;靶位点的选择对高效siRNA的设计也有重要作用。