共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒的构建及其在小鼠模型上的免疫原性分析

本研究旨在以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组腺病毒疫苗。首先利用重叠PCR将GP5和E2基因通过口蹄疫病毒(FMDV)2A序列连接,形成一个完整的ORF,并将其克隆到腺病毒穿梭载体中,通过细菌内同源重组构建共表达PRRSVGP5蛋白和CSFVE2蛋白的重组腺病毒(rAdV-GP52AE2)。间接免疫荧光试验和western blot检测证实2个外源基因均获得表达。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,rAdV-GP52AE2免疫组针对CSFV的中和抗体滴度可达1∶128,针对PRRSV的中和抗体滴度为1∶16;在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。这些结果显示,利用具有自动剪切功能的FMDV2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。

伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含UL18全长基因的片段并克隆至pMD18-T载体,采用双脱氧末端终止法测序。序列分析显示UL18全长891bp,可编码297个氨基酸。将该基因亚克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6×His-UL18的分子量约为33ku。Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。进一步将UL18基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48h时则主要定位在细胞核,但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中。

稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

为构建稳定表达T7RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coliBL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7。采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性。本研究建立稳定表达T7RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法。

2014年规模化猪场临床主要疫病的血清学检测

华中农业大学动物疫病诊断中心2014年针对全国26个省市地区规模化猪场送检的38 375份血清样品进行了临床常见疫病的血清学分析,主要包括猪瘟(HC)、伪狂犬病(PR)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS,猪蓝耳病)、猪圆环病毒病(PCV2)、猪细小病毒病(PP)、乙型脑炎(JE)等。结果显示,送检血清样品猪瘟抗体检测阳性率为80.56%,其中育肥猪和保育猪送检样品的猪瘟抗体阳性率分别为72.23%和46.23%。伪狂犬病野毒鉴别诊断阳性检出率为27.34%,高于往年同期水平。猪繁殖与呼吸综合征抗体平均阳性率为80.76%。圆环病毒病抗体阳性率为79.55%。

露天采煤倾斜开采方法研究

1 矿区概况 霍林河矿务局南露天矿座落在内蒙古自治区哲里木盟境内,是我国自行设计,自己建设的第一座大型露天煤矿。该矿采用单斗—汽车生产工艺,总体设计规模为1000×10~4t/a,分两期建成。一期工程300×10~4t/a于1981年9月1日破土动工,经过三年的艰苦努力,于1984年9月1日移交投产;二期700万t/a扩建工程于1988年9月1日开工,按设计1992年9月3日移交投产,1994年形成1000×10~4t/a生产能力。

露天矿采用倾斜开采方法研究

露天矿采用倾斜开采方法研究常天明，王冲，刘金华从１９８４年５月开始，我们在＋８９２新水平延深开拓工程施工中，在开采１７煤层、第１４煤层和第１０层煤层时均采用倾斜开采方法，并取得了较好的经济效果．一、原设计开采方法简介１、延深方式设计造用的延深方式为：...

以质量求生存 向管理要效益——全质管理在南露天矿煤炭生产中应用

产品质量的优劣尤关企业的生存与发展,实现生产高效益则是企业所追求的最终目标,煤矿生产就是要千方百计地降低原煤灰分,减少矸石混入来提高经济效益,增强企业的生机和活力.为实现这一目标,就必须从煤炭产的全过程入手,依靠科技进步,全面加强质量管理,以优质的工作质量求得优质的工程质量,进而保煤产品质量 .

采用RNAscope原位杂交技术检测PRRSV与PCV2的共感染

RNAscope原位杂交是一种检测细胞内靶标RNA的新型检测技术,为验证该技术能否用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒2型(PRRSV-PCV2)的共感染,本研究针对PRRSV N基因和PCV2 Rep基因序列,分别设计两组特异性探针,利用RNAscope原位杂交技术分别检测了PRRSV和PCV2单独感染或PRRSV-PCV2共感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)以及一例PRRSV-PCV2共感染猪的多个组织样品,同时采用间接免疫荧光试验(IFA)以及RNAscope原位杂交联合IFA对PRRSV和PCV2单独感染或PRRSV-PCV2共感染的PAMs进行检测。结果显示,通过RNAscope原位杂交技术检测PRRSV N基因和PCV2 Rep基因检测到同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染;通过IFA检测PRRSV Nsp9蛋白和PCV2 Cap蛋白检测到同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染;两种方法联合使用结果显示,通过RNAscope探针检测PRRSV N基因和IFA方法检测PCV2 Cap蛋白,或者通过RNAscope探针检测PCV2 Rep基因同时用IFA方法检测PRRSV Nsp9蛋白来检测同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染。同时,RNAscope原位杂交技术能够在PRRSV-PCV2共感染猪的肺脏、脾脏和淋巴结的组织切片中检测到PRRSV和PCV2共感染的细胞。以上结果表明RNAscope原位杂交技术适用于PRRSV-PCV2共感染的细胞和组织样品的检测,为研究PRRSV-PCV2共感染及协同致病机制奠定了基础。

矿山重大生产设备国产化进程中管理运行机制研究

前言 1987年以来,国产重大设备SF—3103型和LN—3101型108t电动轮矿用自卸汽车,WD—1200型和WK—10B型12m^3机械挖掘机及早些时候购进的LN—392型68t机械传动矿用自卸汽车等先后投入生产运行。

提前启用西排土场提高矿山经济效益

1 原排弃方案简介 霍林河南露天煤矿是一座大型褐煤露天矿,国家“八五”重点能源建设项目之一。该矿采用单斗—汽车生产工艺,总体设计能力为10×10~6t/a,分两期建成。首期3×10~6t/a,已于1984年9月1日移交;扩建工程7×10~6t/a,于1992年9月3日移交投产。

化学成分对马氏体沉淀硬化不锈钢性能的影响

三个炉次的马氏体沉淀硬化不锈钢,进行化学成分对力学性能影响的热处理工艺试验,热处理后进行力学性能检测及金相显微组织分析。结果表明:含碳量和镍当量对力学性能的影响最大,随着含碳量的减小,强度、硬度提高;随着镍当量降低,强度、硬度提高;金相显微组织分析的结果同力学性能数值的变化一致。结论对优化控制化学成分有指导意义。

非洲猪瘟防控:疏于意识,死于细节

[目的]分析近4年来,我国养猪企业防控非洲猪瘟的经历和存在的问题并提出对策。[方法]通过兽医流行病学调查、生物安全审计、企业走访、行业会议讨论等多种形式展开研究。[结果]发现非洲猪瘟防控在技术层面不断更新,但是在执行层面出现下降;疏于意识,死于细节。[结论]非洲猪瘟防控是一项系统工程,既要在日常操作中做好细节工作,更要在意识形态上强化思想认知。

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。

六种检测猪瘟病毒方法的比较

【目的】本研究旨在比较6种检测猪瘟病毒方法的优缺点。【方法】应用病毒分离、胶体金免疫层析试纸条、抗原捕捉ELISA、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、TaqMan荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)等6种方法,分别对50份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)进行检测。【结果】结果表明:RT-qPCR和RT-LAMP方法检出阳性样品数为13份,RT-PCR为11份,病毒分离为10份,抗原捕捉ELISA为9份,胶体金试纸条为8份;6种方法均检测为阳性8份,均为阴性37份。【结论】结果提示,在对猪瘟病毒进行检测时,RT-qPCR、RT-LAMP和RT-PCR由于其灵敏性高,可作为首选检测方法,但操作时需要避免假阳性的出现;病毒分离方法虽然操作繁琐,但结果准确,是确诊猪瘟必不可少的检测方法;抗原捕捉ELISA和胶体金试纸条检测时间较短,由于其敏感性较低所限,主要用于对畜群进行检测,不适合个体检测。

猪γ干扰素的表达及其抗病毒活性的安全检测

为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性,本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒(VSV△G*G)为指示病毒,分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素(PoIFN-γ)在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示:由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性,其抗病毒活性为105IU/mL,原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性,其抗病毒活性为32IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒(VSV*GFP)所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致,表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品,使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。

猪瘟兔化弱毒疫苗RT-LAMP检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的NS5B基因序列,利用在线软件Pri mer Explorer V4Software,设计了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立了特异性检测HCLV的RT-LAMP方法。在BstDNA聚合酶作用下,65℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物可通过20g/L琼脂糖凝胶电泳或加入SYBR GreenⅠ染料进行分析。经检测,该方法对于CSFV、BVDV以及其他猪源病毒无特异性扩增,具有良好的HCLV特异性;其灵敏度与本实验室建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测结果一致,均达到5个拷贝。分别用这两种方法对58份市售猪瘟弱毒疫苗进行检测,结果符合率达100%。表明,建立的HCLV RT-LAMP技术可以应用于基层实验室或养殖场,便于养殖户对疫苗中的弱毒含量进行监测。

猪瘟病毒单克隆抗体的研究进展

概述了国内外研制的针对猪瘟病毒E2、Erns和NS3蛋白的单克隆抗体及它们在猪瘟病毒抗原性分析、抗原表位研究及猪瘟诊断和鉴别诊断中的应用,并对其今后的研究和应用前景进行了展望。

霍林河露天煤矿大型设备运转状况的分析

大型露天采矿设备的能力计算历来是采矿设计、生产的关键问题之一。本文依据霍林河露天煤矿的大型采运设备作业指标,全面科学地分析了大型露采设备作业状况,以供设计、生产借鉴。