猪流感病毒分离株A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分子特性研究

采用套式PCR检测方法,结合鸡胚分离鉴定,从20份患呼吸道疾病猪的鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒。经亚型鉴定及全基因组序列分析,证实该分离株为H1N1流感病毒,命名为A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）。遗传进化分析表明该分离株与类禽猪流感病毒（Avian-Like H1N1）相似性最高。蛋白序列分析发现,该分离株具有低致病性流感病毒特征,即其HA蛋白的裂解位点为PSIQSR↓GLFGAI。此外,该基因中有7个潜在的糖基化位点,受体结合位点为108（Y）、148~152（GVTAA）、167（W）、197（H）、204~212（DQQ SLYQNA）和238~243（RDQEGR）;其中225~228EQAG显示该分离株具有结合SAα2,6Gal受体的能力,证明该分离株具有感染哺乳动物的能力。同时PB2蛋白的627E、701N及NS蛋白的92D位点均证明了该分离株的低致病性和感染哺乳动物的能力。

猪流行性腹泻病毒S蛋白富含表位区域的原核表达与鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻的重要病原之一,给世界养猪业带来严重危害。本研究对PEDV分离株JS-2纤突蛋白(S)进行抗原表位分析,选择3个富含表位片段的区域。通过RT-PCR扩增基因序列,克隆入p ET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,成功表达了3个重组蛋白,分子质量与预期大小一致。将蛋白进行割胶回收,与油佐剂乳化后免疫小鼠,制备超免疫血清,利用PEDV包被抗原进行ELISA检测,结果免疫小鼠血清D450值达1.0左右,证实筛选制备的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

猪四种病毒性腹泻病原多重PCR检测方法的建立及应用

分别以猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因、猪轮状病毒(Po RV)VP6基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因、猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Npro基因为靶基因,参照Gen Bank上登录的基因序列,利用DNAStar和Oligo7软件设计了4对引物。采用PCR分别扩增各病毒基因,并克隆至p MD18-T载体,获得4个阳性重组质粒。以重组质粒为模板,进行多重PCR方法的优化。特异性试验检测可分别扩增出相应的病毒基因片段;敏感性试验结果显示,检测PEDV、TGEV、Po RV及BVDV质粒的最低拷贝数分别为730copies/L、547 copies/L、6.47×103copies/L、705 copies/L。应用该方法对猪场44份猪腹泻样品进行检测,结果检出15份PEDV样品,3份TGEV样品,2份BVDV样品,其中PEDV与TGEV混合感染样品2份,TGEV与BVDV混合感染样品1份。随机抽取其中2份PEDV阳性样品进行病毒分离,病毒经细胞传3代以上PCR检测均为阳性,对PCR产物测序证实为PEDV。结果表明,本研究建立的多重PCR方法具有快速、简便、特异性强、敏感度高的特点,能够对PEDV、Po RV、TGEV和BVDV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。