Panton-Valentine杀白细胞素原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的原核表达金黄色葡萄球菌Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)蛋白,并进行生物学活性鉴定。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌DNA,利用PCR扩增LukF-PV和LukS-PV编码基因,亚克隆入表达载体pET28 a,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21株,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后获得可溶性的蛋白,Western blot对其鉴定。并以人多形核粒细胞(PMNs)为靶细胞检测其生物学活性。结果成功构建了LukF-PV和LukS-PV基因的表达载体,经IPTG诱导和亲和层析纯化法获得重组蛋白,Western blot鉴定证实其为重组PVL蛋白。实验表明该蛋白具有诱导人多形核粒细胞(PMNs)凋亡的作用。结论成功地表达获得了具有生物学活性的PVL重组蛋白,为PVL快速检测方法的建立和致病机制研究奠定基础。

恶性血液病患者感染病原菌分布及耐药性分析

目的了解恶性血液病患者发生细菌感染的特点及病原菌的耐药性特征,为临床合理用药提供依据。方法对安徽医科大学附属省立医院111例恶性血液病患者中分离的病原菌的分布进行回顾性分析,结合临床抗菌药物使用情况分析其对抗菌药物耐药性特征。结果最常见细菌感染部位为血流感染(69例,62.2%),其次为呼吸道感染(22例,19.8%)。病原细菌中革兰阴性杆菌占75%,其余为革兰阳性球菌;同时检出7株真菌。各类病原菌的耐药性严重,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs的检出率分别为82.9%和54.5%;葡萄球菌中分别检出MRSA 2株和MRCNS 12株。革兰阴性菌对亚胺培南、头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星仍有较好敏感性,葡萄球菌对万古霉素、利奈唑胺、奎奴普丁-达福普汀仍较敏感。鉴于ESBLs的高检出率,头孢菌素类抗生素可能已不适宜作为经验用药。结论恶性血液病患者中分离的菌株多重耐药情况严重。应参考本地区感染细菌分布和耐药特点合理选择抗菌药物。

不同染色方法对肺孢子菌的诊断作用比较

目的比较革兰染色、苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin stain,HE)、吉姆萨染色(Giemsa stain)和六胺银染色(Gomoris Methenamine silver nitrate stain,GMS)在诊断肺孢子菌肺炎中的作用。方法收集1例典型肺孢子菌感染患者的痰液,经消化处理,离心,涂片,分别进行革兰染色、HE染色、吉姆萨和六胺银染色,油镜观察。结果革兰染色未见可疑结构;HE染色肺孢子菌包囊壁不着色,呈透明的晕圈状,囊内小体4～8个呈蓝紫色;吉姆萨染色包囊壁不着色,可见清楚的轮廓,囊内小体核蓝色,囊内容物紫红色;六胺银染色肺孢子菌包囊壁棕到黑色,结构清楚,囊内可见圆形的核状物和特征性的括弧状结构。结论常规使用的革兰染色无法诊断肺孢子菌,其他3种方法均可选择,合理的方案是用吉姆萨染色筛选,用六胺银染色确证。

某院2009～2011年尿培养中细菌分布及耐药性分析

目的监测和分析本院2009～2011年尿培养分离病原菌的种类、分布及耐药状况,指导临床合理运用抗菌药物。方法采用VITEK 2Compact系统对尿培养阳性标本分离菌株进行鉴定及药敏分析,应用WHONET 5.6软件分析中段尿培养标本所分离病原菌的分布及药敏情况。结果 3 571例尿培养标本中共分离出1 046株病原菌,阳性率为29.3%,其中革兰阴性菌601株,占57.5%,尤以大肠埃希菌最为常见；革兰阳性菌261株,占24.9%,以葡萄球菌和肠球菌为主；真菌184株,占17.6%。病原菌对各种抗菌药物耐药差异性较大,表现为多药耐药。结论本院尿路感染病原菌种类复杂多样、耐药程度严重,需及时监测病原菌的菌群种类分布和耐药变迁,以指导临床合理、规范地使用抗菌药物。

金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素对THP-1巨噬细胞活性及凋亡/坏死的作用

目的探讨金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素(PVL)对THP-1巨噬细胞活性及凋亡/坏死的作用。方法采用CCK-8比色法检测重组PV-杀白细胞素(rPVL)对THP-1巨噬细胞活性的影响;应用流式细胞仪检测THP-1巨噬细胞凋亡/坏死率;用Western blot法检测rPVL刺激THP-1巨噬细胞NF-κB的蛋白表达。结果随着rPVL对THP-1巨噬细胞作用的浓度和时间的增加,细胞活性进行性下降,在低浓度(5 nmol/L rPVL)以凋亡为主,在高浓度(40 nmol/L rPVL)以坏死为主,且具有时间依赖性。NF-κB的蛋白在高浓度(40 nmol/L rPVL)刺激下活化,2 h量表达最大,具有时间依赖性。结论 rPVL对THP-1细胞有毒性作用,低浓度诱导其凋亡、高浓度促进坏死,并能活化NF-κB的蛋白。

下呼吸道感染病原菌分布及耐药性分析

目的分析下呼吸道感染常见病原菌分布及耐药性变迁情况,为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法对临床送检痰标本进行分离培养,应用VITEK-2微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏试验,采用WHONET5.4软件对数据进行统计分析。结果共分离病原菌3 050株,其中革兰阴性杆菌2 425株,占79.51%,革兰阳性球菌431株占14.13%,真菌194株占6.36%。革兰阴性杆菌中前4位的细菌分别为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌;其中鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率分别为75.0%和34.8%。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌ESBLs阳性率分别为81.4%、44.6%,且肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率达18.9%。革兰阳性球菌主要为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌;其中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离率达68.6%,未发现万古霉素耐药。结论本院下呼吸道感染病原菌以革兰阴性杆菌为主。非发酵菌最为常见且耐药问题较为严重。革兰阳性球菌未发现万古霉素耐药菌株。

rPVL对Balb/C小鼠肺组织损伤及细胞因子的影响

目的研究rPVL对Balb/C小鼠肺组织损伤及肺组织匀浆中细胞因子的影响。方法 20只成年Balb/C小鼠分两组,对照组、rPVL组。对照组注射生理盐水,rPVL组注射rPVL,两组分别于注射后3 h、9 h处死小鼠,每个时间段5只,ELISA方法测肺组织匀浆中TNF-α、IL-8水平,RT-PCR方法测肺组织匀浆TNF-α、IL-8mRNA的表达。结果 rPVL刺激小鼠后3 h、9 h肺组织匀浆TNF-α、IL-8蛋白含量、mRNA表达量均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),rPVL组TNF-α、IL-8蛋白含量、mRNA表达量随时间延长而升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 rPVL能引起小鼠肺组织严重损伤,且肺组织匀浆中TNF-α、IL-8大量释放,提示细胞因子在rPVL对小鼠肺组织损伤过程中起重要作用。

重组PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体并鉴定。方法纯化获得重组蛋白LukF-PV,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA法测定抗体滴度,Western blotting法鉴定免疫活性。结果成功免疫新西兰白兔获得多抗血清,ELISA测定其效价为1∶103,Western blotting鉴定其能识别重组蛋白和金葡菌PVL蛋白。结论成功制备出重组金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体,并进行鉴定,为建立产杀白细胞素的金黄色葡萄球菌的快速、廉价的免疫学检测方法奠定基础。

不同方法接种构建的SCID小鼠HL-60白血病模型生物学特性分析

采用皮下(A组)及腹腔(B组)2种途径将HL-60细胞接种于经环磷酰胺预处理的SCID小鼠。C组小鼠不做处理作为正常对照。比较不同接种方法构建的小鼠HL-60白血病模型的生物学特性。结果表明皮下、腹腔注射培养的HL-60细胞于SCID小鼠体内均可成瘤。皮下注射成瘤时间短,存活时间长;腹腔注射成瘤时间长,存活时间短。腹腔注射脏器浸润较皮下成瘤严重。接种细胞4周后,B组小鼠外周血白细胞数较A和C组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。A和B两组小鼠外周血都有白血病细胞浸润,但是比例较低,不超过3%。

生物被膜感染特征及防治策略研究进展

生物被膜是细菌或真菌为了适应外界环境,粘附于非生物或活性组织表面,并包被于自身产生的黏液性不均一的胞外基质中形成的一种与浮游菌生长方式不同的微生物群。随着医用植入物和假体的使用增加,免疫力低下人群增多,生物被膜相关感染的发病率逐年上升。生物被膜的形成导致细菌对抗生素广泛耐受,感染迁延难愈,严重危害人类健康。本文回顾性地对生物被膜相关感染的病原体、感染特征、诊断、治疗及预防策略等研究进展进行综述,以期为生物被膜感染防治提供参考。

血液病患者血流感染病原菌分布及耐药性分析

目的分析本院血液科住院患者血流感染病原菌的分布和耐药情况,为临床合理使用抗菌药物,减缓细菌耐药性产生提供依据.方法应用BACT/ALERT3D全自动血培养仪对临床送检的血培养标本进行培养,使用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统对血培养阳性标本分离菌株进行菌种鉴定及药敏试验,应用WHONET 5.6软件对病原菌分布和药敏结果进行统计分析.结果2017年10月~2018年9月本院血液科住院患者血培养阳性标本中共分离病原菌101株,其中革兰阴性菌77株(76.24%),主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌;革兰阳性菌23株(22.77%),主要为凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和金黄色葡萄球菌(金葡菌);真菌1株(0.99%),为热带假丝酵母菌.移植和非移植患者病原菌分布构成略有不同.产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的检出率分别为42.9%和55.0%.检出亚胺培南耐药的大肠埃希菌1株(2.9%),肺炎克雷伯菌3株(15%).铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药率均较低.6株金葡菌中检出耐甲氧西林金葡菌2株(33.3%).12株CNS中检出8株耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(66.7%).主要革兰阳性菌对万古霉素、利奈唑胺、替加环素和奎奴普丁/达福普汀敏感率均达100%.结论本院血液科血流感染病原菌种类复杂多样、革兰阴性菌所占比例居多,且多重耐药菌检出率高,及时监测病原菌的菌属分布和耐药变迁,可指导临床合理、规范地使用抗菌药物.

41例梅毒患者脑脊液检测结果分析

目的分析梅毒患者脑脊液的实验室检查结果,探讨脑脊液检查在神经梅毒诊断中的价值。方法回顾性分析本院2015年11月～2016年10月收治的41例梅毒患者脑脊液的甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)、梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA),以及常规、生化和免疫球蛋白IgG检查的结果。结果确诊神经梅毒13例,神经梅毒疑似4例,排除神经梅毒24例。41例梅毒患者脑脊液检查中,TRUST阳性9例;TPPA阳性17例;白细胞升高(>10×10~6/L)3例(3/13);蛋白异常(>0.6 g/L)7例(7/13),IgG升高(>34 mg/L)11例(11/13);葡萄糖和氯化物基本正常;神经梅毒组与非神经梅毒组比较,脑脊液检查相关指标的差异有统计学意义。结论神经梅毒发病隐匿,症状无特异性,易造成误诊或漏诊,对疑似病例应尽早做脑脊液相关检查,可为神经梅毒的早期诊断和治疗提供重要依据。

10例布鲁氏菌病临床及实验室特征分析

目的总结分析布鲁氏菌病的临床及实验室特征,提高非疫区医生及检验人员对该病的认识.方法回顾分析我院2015年~2018年收治的10例布鲁氏菌病患者临床资料、流行病学特点及实验室检查结果.结果本资料中布鲁氏菌病患者发病季节主要在3月~8月,中年男性为主,其中70%患者有明确病畜接触史.实验室检查WBC正常或减低,80%患者C-反应蛋白(CRP)、血沉(ESR)升高;所有患者均行血培养检查,血培养平均报阳时间为3.8天,经VITEK2 Compact全自动细菌鉴定仪鉴定为布鲁氏菌.结论布鲁氏菌病临床表现及实验室检查缺乏特异性,非疫区医务人员均应提高对该病的认识,对不明原因长期发热或关节肌肉疼痛经常规治疗无效时,应考虑到布鲁氏菌病,及早进行血培养检查,并及时与实验室沟通,避免漏检误检.

阿尼玛原型视域下的鲁迅小说女性形象解读

阿尼玛作为无意识的一个方面,深深地影响着人的精神生活。阿尼玛形象通常都是通过女人得到外向化,男性心中的阿尼玛原型决定了他们对于异性的情感投射,在阿尼玛原型的关照下可以更好地解读鲁迅小说中的女性形象所形成和表现的"无妻性"特点。

新型冠状病毒核酸检测循环阈值变化规律浅析

目的初步探讨新型冠状病毒感染者呼吸道标本核酸扩增循环阈值(cycle threshold,Ct值)变化规律。方法筛选2020年1月21日至2020年3月2日间安徽省某定点医院收治的45例新型冠状病毒感染确诊患者,用实时荧光逆转录聚合酶链反应技术对患者的痰液与咽拭子混合液进行检测,观察Ct值与发病天数、性别、年龄、疾病分型的变化规律。结果随着发病天数的增加,ORF1ab基因、N基因及E基因Ct值均不断升高,E基因首先消失,其次是ORF1ab基因,最后是N基因。出现症状后1~6 d男性与女性核酸Ct值均为最低值,差异无统计学意义(P>0.05);7~12 d Ct值逐渐升高,男性低于女性Ct值,两者差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄段间Ct值差异无统计学意义(P>0.05)。不同病情分型间Ct值差异无统计学意义(P>0.05)。结论Ct值与患者出现症状的天数、性别有关,与年龄、疾病分型无关。

金黄色葡萄球菌LukS-PV-GFP融合蛋白的载体构建及表达纯化

目的构建LukS-PV与GFP融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达纯化并鉴定。方法煮沸法提取金黄色葡萄球菌铜23的DNA作为模板,PCR扩增得到LukS-PV基因产物,经胶回收后与pMDN8T质粒连接过夜后转化至感受态菌DH5$中。提取质粒经PCR、测序鉴定无误,双酶切后连接到peW8a和6HTFP载体上,先转化至感受态菌DH5$再转化到BL21宿主菌中。对LukS-PV-GFP表达产物使用SDS-PAGE电泳分析,并取诱导前和IPTG诱导5 h菌液涂片置于荧光显微镜下观察。使用Western blot对诱导前及纯化后蛋白进行鉴定。结果成功构建了LukS-PV与GFP融合蛋白表达载体,诱导纯化后获得较高浓度和纯度的重组融合蛋白,且诱导前无荧光,诱导后宿主菌BL21可在荧光显微镜下显示绿色荧光。Western blot结果显示纯化后蛋白出现特异性条带&结论成功地纯化得到了具有生物学活性的LukS-PV-GFP重组融合蛋白,为进一步研究LukS-PV的功能定位和相互作用奠定了基础.

金黄色葡萄球菌二元调控系统vraSR基因敲除菌株的构建及其致病性研究

利用基因敲除及基因回补技术构建异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌标准菌株(Mu3)vraSR基因敲除株(ΔvraSR)及基因回补株(CΔvraSR),使用小鼠皮肤脓肿形成模型研究VraSR在金黄色葡萄球菌致病性中的作用。PCR及RT-PCR验证vraSR基因敲除株及其回补株构建成功。与野生株Mu3比较,ΔvraSR菌株小鼠皮肤脓肿面积显著减小(P<0.001),皮肤组织荷菌量明显减低(P<0.01),皮肤组织病理损伤减轻。CΔvraSR株可以恢复致病性。VraSR可增加金黄葡萄球菌的致病性。

金葡菌杀白细胞素S组分LukS-PV抑制急性髓系白血病细胞增殖的机制研究

目的 探讨金葡菌杀白细胞素S组分LukS-PV通过下调甲基转移酶SET8对急性髓系白血病(AML)细胞THP-1和HL-60增殖的影响。方法 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测不同浓度LukS-PV处理后THP-1和HL-60细胞的SET8 mRNA和蛋白的表达水平。将敲低SET8表达的慢病毒载体转染至THP-1和HL-60细胞中,qRT-PCR和Western blot检测SET8敲低效率,EdU实验检测敲低SET8对细胞增殖的影响。在敲低SET8的基础上,加入LukS-PV处理,通过EdU检测细胞增殖探究LukS-PV是否通过下调SET8抑制白血病细胞THP-1和HL-60的增殖。结果 在AML细胞系THP-1和HL-60中,与PBS对照组相比,LukS-PV处理组SET8及其修饰位点H4K20me1的表达水平明显降低并具有浓度依赖性(P<0.05)。与阴性对照组相比,在THP-1和HL-60细胞转染敲低SET8慢病毒载体后,SET8表达水平明显降低(P<0.05),细胞增殖能力明显降低(P<0.05)。与PBS对照组相比,敲低SET8可抑制细胞增殖(P<0.05),而在此基础上加入LukS-PV处理后,细胞增殖抑制更加明显(P<0.05)。结论 下调SET8抑制AML细胞THP-1和HL-60的增殖;且LukS-PV可以通过下调SET8抑制细胞增殖,发挥抗白血病作用。

121株金黄色葡萄球菌临床分离株的分子流行病学及遗传学特征

目的研究临床分离的金黄色葡萄球菌株的分子及遗传学特征.方法收集中国科学技术大学附属第一医院及安徽中医药大学第一附属医院2018-2019年临床检出的非重复金黄色葡萄球菌121株,检测其δ溶血、mecA基因、Agr系统分型、Spa分型等,并对mec A基因阳性菌株进行SCCmec分型.结果121株金黄色葡萄球菌中有甲氧西林耐药菌株(MRSA)67株,甲氧西林敏感菌株(MSSA)54株;MRSA菌株主要携带Ⅲ型SCCmec元件(18,26.86%)和Ⅳ型SCCmec元件(24,35.82%);Agr系统主要为Ⅰ型和Ⅱ型;121株临床菌株中共有Spa类型54种,最为常见的是t437(15,12.40%)和t034(9,7.44%);在12株δ溶血阴性的金黄色葡萄球菌中有11株(91.67%)为MRSA菌株,δ溶血阴性的金黄色葡萄球菌携带的Agr系统类型主要为Ⅱ型(50.00%),携带的SCCmec元件主要为Ⅱ型(占58.33%),δ溶血阴性的金黄色葡萄球菌中共有Spa类型8种,最为常见的是t18363(41.67%).结论本研究阐述了医院分离的金黄色葡萄球菌分子及遗传学特征信息,有助于追踪医院内流行性金黄色葡萄球菌株的出现、传播,并提供对临床感染控制策略.

产P-V杀白细胞素金黄色葡萄球菌肺炎诊断与治疗

产Panton-Valentine杀白细胞素(Panton-Valentine Leukocidin,PVL)金黄色葡萄球菌近年来在全球范围广泛流行,并引起严重感染性疾病。PVL与一种以健康年轻人为主要感染人群的高发病率、高病死率坏死性肺炎密切相关,日渐受到广泛关注。本文就PVL的生物学特性、致病性、PVL相关的坏死性肺炎的诊断与治疗等作一综述。