新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与常见家养动物冠状病毒的同源性分析

冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是一类具有囊膜的单链RNA病毒,也是目前已知的基因组最大的RNA病毒,在分类上属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)[1]。该病毒可以引起动物呼吸道、消化道和神经系统疾病,主要感染人和脊椎动物,后者主要包括猪、牛、犬、猫、鼠、禽类和一些其他动物(含野生动物)等。冠状病毒科分为4个属,即α、β、γ和δ属[2-3]。其中,α属冠状病毒感染人、长翼蝠、猪、犬、猫等[4];β属冠状病毒感染人、猪、牛、马、鼠、家蝠等,人们熟知的引起严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)的冠状病毒和引起中东呼吸综合征(Middle east respiratory syndrome,MERS)的相关病毒等[5]均属β属冠状病毒;γ属冠状病毒感染禽和白鲸2个种,其中最主要的是引起禽传染性支气管炎(Infectious brochitis,IB)[6];δ属冠状病毒感染猪、夜莺、文鸟等[7]。

2017—2019年华东地区猪场主要病毒性腹泻病原调查

本研究旨在了解当前我国华东地区引起猪腹泻的主要病毒性腹泻病原的流行情况,为该地区更好地开展猪腹泻病毒的防控工作提供临床数据。分别采用RT-PCR检测方法对2017—2019年华东地区35个场别594份临床样品检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪萨佩罗病毒(porcine Sapelovirus,PSV)等5种猪的病毒性腹泻病原,并对其阳性率及混合感染情况进行统计分析。结果显示,2017—2019年的PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV及PSV的平均阳性率为分别为62.6%(372/594)、27.9%(166/594)、16.8%(100/594)、13.3%(79/594)及3.87%(23/594),二重混合感染中以PEDV+PDCoV及PEDV+PoRV为主,平均混合感染率分别为22.4%(133/594)和13.3%(79/594)。三重感染中以PEDV+PoRV+PDCoV混合感染为主,感染率为7.58%(45/594),未见四重及五重病原混合感染。2017—2019年PEDV平均阳性检出率最高,且常与PoRV及PDCoV发生混合感染,是当前华东地区猪病毒性腹泻类疫病的防控重点。TGEV和PDCoV在健康育肥猪及母猪的检出率中占比较大,表明隐性感染变得普遍,值得养殖户关注。除此之外,PSV的检出率远低于其他4种腹泻病毒。总之,随着2018年后养殖场加强生物安全防控措施和猪群管理,各病原检出率和阳性场检出率呈现逐年下降趋势。

华东地区猪A群轮状病毒的VP7和VP4基因序列分析

为了掌握华东地区猪轮状病毒(PRV)的流行情况,通过对华东地区猪轮状病毒流行病学的调查,分析临床猪轮状病毒对应的2个抗原序列VP7和VP4的基因型,进而丰富VP7和VP4基因库。采集2017-2018年华东地区包括江苏、浙江、上海、山东、安徽等省(市),部分猪场猪的粪便拭子共201份,PCR检测PRV阳性52份,阳性率25.9%。选择5个阳性样本进行VP7和VP4基因全长扩增并克隆测序,应用DNASTAR、MEGA5等生物学软件对其进行比对分析。结果显示:5个VP7核苷酸序列全长均为1 062 bp,5个VP4序列全长均为2 362 bp。VP7与2008年分离的G9型代表毒株NMTL的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93.2%~95.2%和97.2%~97.5%。VP4与OSU毒株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98.5%~98.7%和99.3%~99.4%。表明这5株猪轮状病毒的基因型鉴定为G9P7。与参考毒株相比,VP7氨基酸第100、122、180、309位有突变,但无插入和缺失现象,VP4氨基酸在第30、137、686、774位有突变,但无插入和缺失。

猪轮状病毒NJ2012株VP8基因序列分析及原核表达

为深入研究猪轮状病毒VP8蛋白的结构和功能,以及研制新型猪轮状病毒疫苗,利用生物信息学软件DNAStar对本研究室保存的1株A组G9P7型猪轮状病毒NJ2012的VP8基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法扩增VP8蛋白编码基因,用限制性核酸内切酶对目的片段与pET28a(+)原核表达载体进行双酶切,构建了重组原核表达载体,用IPTG诱导表达,并进行Western blot验证。结果显示:NJ2012毒株的VP8基因序列与参考毒株序列的核苷酸同源性为53.9%~99.2%,氨基酸同源性为42.1%~97.5%;VP8基因克隆成功,经测序与目的基因完全一致;经鉴定,构建的重组原核表达质粒pET28a-VP8能够在DE3宿主菌中表达,该蛋白以包涵体形式存在;Western blot结果显示该蛋白可与抗His-tag鼠单克隆抗体发生特异性反应。本研究实现了VP8蛋白在原核系统中稳定表达,为调查该蛋白的免疫原性及研制安全、高效的猪轮状病毒亚单位疫苗提供了参考。