环状RNA mmu_circ_0001083对牛肠道病毒HY12复制的影响

环状RNA(circRNA)是一类特殊的呈闭合环状结构的非编码RNA,参与多种生物学过程,如细胞增殖、分化和凋亡,在多种疾病发生中发挥重要作用,同时也是潜在的生物标志物和治疗靶点。为探索circRNA对病毒复制的影响,本研究对HY12肠道病毒感染MC38细胞的circRNA差异表达进行了组学测定与分析,发现在HY12病毒感染后有570个circRNA表达水平上调,381个circRNA表达水平下调。在570个表达上调的circRNA中,选择差异显著上调的circRNA mmu_circ_0001083为研究对象,探讨其与HY12感染之间的关联以及对病毒复制的影响。结果显示,HY12病毒感染细胞后,宿主环状RNA mmu_circ_0001083的表达显著上升,且其表达水平呈现病毒剂量与时间依赖性。与感染正常MC38细胞相比,HY12病毒感染环状RNA mmu_circ_0001083敲低的MC38细胞后,其2C蛋白表达减少,病毒滴度显著降低。相反,HY12病毒感染过表达环状RNA mmu_circ_0001083的MC38细胞后,其2C蛋白表达增加,病毒滴度明显升高。上述结果表明,宿主环状RNA mmu_circ_0001083的表达上调与HY12病毒感染复制呈显著正相关,即mmu_circ_0001083对HY12的复制起到了正向调控的作用,该结果为今后深入研究环状RNA对HY12病毒复制的调控机制打下基础。

国内新发D种库布病毒L蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

根据从病牛体内分离的国内首株D种库布病毒(Kobuvirus,KoV)的基因组序列,应用RT-PCR技术扩增出L蛋白基因片段,并将其克隆到原核表达载体中,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-KoV-L。将重组质粒转化到BL21(DE3)中,通过大肠杆菌表达系统诱导表达重组蛋白GST-L。以纯化的重组蛋白作为免疫原,与弗式佐剂混合乳化后免疫BALB/c小鼠,采集血清效价较高小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经过筛选和4次亚克隆获得3株能够稳定分泌抗L蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,3F3和4G10单抗的亚型为IgG1,4F5单抗亚型为IgG2a。特异性和稳定性试验结果显示,获得的3株单克隆抗体均可以特异性检出D种KoV抗原。利用蛋白截断技术与Western blot方法确定了3株单抗识别的抗原表位区域。进一步通过肽扫描法和间接ELISA方法确定了3F3、4F5和4G10单克隆抗体的抗原表位分别为L蛋白氨基酸序列中的^(97)RICAKTLPGPWHS^(107)、^(105)GPWHSKLTKAERIF^(118)和^(13)ERPFHYSLPKPSS^(25)部位。本研究首次获得了抗D种KoV的3株单克隆抗体,并确定了其抗原表位位点,该结果为库布病毒感染的诊断方法建立、致病机制以及L蛋白功能的研究奠定了基础。

河南省牛肠道病毒的遗传变异分析

为了解河南省不同地区牛肠道病毒(BEV)的遗传变异与病毒株间的分子差异,本研究应用PCR方法从河南省不同地区牛场确定为BEV的阳性样品或病毒分离株中扩增了病毒VP1基因并对其进行了序列测定和分析,结果显示检测出的11株BEV中,8株属于E种肠道病毒(EV-E),3株属于F种肠道病毒(EV-F)。VP1基因核苷酸序列的比对分析结果表明,8株不同EV-E毒株间的VP1同源性为70.4%~98.6%,它们与本实验室分离的国内首株EV-E HY12毒株的同源性为69.3%~80.3%;EV-F HeN-A12和HeN-YR91毒株与国内首株EV-F毒株BHM26的同源性为68.6%和70.8%,而与首株山羊EV-F毒株SD-S67的同源性为88.8%和73.7%。进一步分析显示,8株EV-E毒株可以进一步分类为2个基因型EV-E2和EV-E3;而3株EV-F毒株也可进一步分类为2个基因型EV-F1和EV-F4。结果表明,河南省不同地区牛群存在EV-E和EV-F感染和肠道病毒感染的多样性以及病毒株的分子差异,该研究为该病的防控提供流行病学理论依据。

从吉林省发生先天性关节弯曲-脑积水综合征新生犊牛分离鉴定出阿卡班病毒

本研究针对吉林省多地发生的一种新生犊牛先天性畸形和脑积水,临床上以四肢关节弯曲呈蜷缩状、无法伸直、不久发生死亡为特征的疾病进行了流行病学调查及病原分离与鉴定。结果应用MDBK细胞从发病与病死动物体内分离出3株病毒,命名为JL-AKA-CC21-1株、JL-AKA-CC21-2株和JL-AKA-YJ21。电镜负染观察显示,分离病毒粒子大小为70~130 nm,与病料中观察的病毒粒子相同。病毒接种MDBK细胞可引起典型的细胞病变,病变细胞聚集、变圆与脱落。分子生物学鉴定结果表明,上述分离毒株均为阿卡班病毒(Akabane virus, AKAV)。本研究从发生新生犊牛先天性畸形和脑积水的病死牛体内分离出AKAV,该研究结果将对今后吉林省本病的防控提供理论依据。

河南省羊肠道病毒的分离与序列测定

应用Vero细胞从河南省某腹泻羊场的粪便样品中分离出2株病毒。电镜观察显示,分离的病毒粒子直径大小为25~30 nm。单层免疫过氧化物酶对分离病毒进行了免疫学鉴定,结果显示分离的2株病毒均与羊肠道病毒CEV-JL14的高免血清发生强阳性反应。对RT-PCR扩增出的病毒基因片段进行了序列测定与比对分析,发现分离的2株病毒与CEV-JL14毒株处于同一分支,均为G种肠道病毒。本研究首次从河南省分离获得了羊肠道病毒,为进一步研究该病打下基础。

基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原ELISA方法的建立及应用

应用制备的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CC13B毒株E2蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV)抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵试验确定的捕获BVDV抗原的单克隆抗体最佳抗体包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释浓度为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准为待检样品D_(490)值≥0.156 7时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果显示,建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的单抗捕获BVDV抗原的夹心ELISA方法,调查了山东、河南和吉林3省部分地区牛群BVDV感染情况,发现上述地区牛群的BVDV感染率低至6%。本研究结果为BVDV感染的诊断、检疫、净化及防制提供了有效的技术手段及流行病学理论依据。

吉林省牛病毒性腹泻病毒与牛肠道病毒混合感染的流行病学调查

应用检测牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)与牛肠道病毒(bovine enterovirus, BEV)抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒,分别对2019-2020年采集于吉林省5个地区的738份粪便样品进行检测,并以PCR和免疫荧光试验对部分样品进行了确证。结果显示,吉林省不同地区、不同年龄及不同品种的牛群均存在BVDV与BEV混合感染,其中,BVDV感染率为10.26%~42.65%,BEV感染率为8.33%~20.83%,2种病毒的混合感染率为3.42%~14.71%。对不同品种牛群BVDV与BEV混合感染的检测结果显示,荷斯坦牛混合感染率为13.04%、西门塔尔牛为7.84%、延边牛为3.65%、利木赞及其他牛群为3.42%。检测不同年龄牛群混合感染的结果显示,各个年龄牛群均存在不同程度的BVDV与BEV混合感染,其中,成年牛群混合感染率高达57.63%,犊牛混合感染率为3.39%。PCR和免疫荧光试验检测结果显示,在BVDV与BEV混合感染的样品中均可同时扩增出或检测出BVDV与BEV的混合感染。本研究首次揭示出吉林省牛群的BVDV与BEV混合感染,丰富了BVDV及BEV感染的流行病学数据,为吉林省乃至国内BVDV与BEV感染的净化及防控提供了流行病学的理论基础。

宿主通过激活NLRP3信号通路抑制HY12肠道病毒的复制

采用Q-PCR、Western blot和ELISA的方法检测巨噬细胞感染HY12病毒后NLRP3、IL-1β和Caspase-1等蛋白的表达水平及细胞上清中IL-1β的表达量,以确定巨噬细胞感染病毒后NLRP3通路的变化情况。同时应用IL-1β预处理小鼠原代巨噬细胞与NLRP3敲除小鼠原代巨噬细胞系,检测HY12病毒感染后细胞中病毒结构蛋白的表达水平,探究了NLRP3通路激活刺激IL-1β分泌对病毒复制的影响,并以小鼠模型进行了验证。结果显示,巨噬细胞感染HY12病毒后激活了NLRP3炎性小体信号通路,上调NLRP3、IL-1β和Caspase-1等蛋白的表达,且表达水平呈现病毒剂量与时间依赖性。同时发现IL-1β预处理的巨噬细胞感染HY12病毒后,病毒结构蛋白表达显著下降;而NLRP3敲除的小鼠巨噬细胞感染HY12病毒后,相比正常巨噬细胞感染病毒后病毒的结构蛋白表达更高。此外,与野生型小鼠感染HY12病毒相比,NLRP3敲除小鼠感染后病毒的复制明显增强。结果表明,宿主在HY12病毒感染后通过激活NLRP3信号通路及刺激IL-1β的分泌,进而抑制病毒的复制。

鉴别牛肠道病毒感染复合PCR方法的建立及初步应用

牛肠道病毒(bovine enterovirus, BEV)感染是国内近年来报道的一种临床上以消化道、呼吸道症状为特点的新发传染病,其病原体为小RNA病毒科肠道病毒属中的成员。目前,BEV分为EV-E和EV-F 2个病毒种,两者间的核苷酸序列差异很大,属于不同的血清型/基因型,常规血清学方法难以将其区别。为建立一种鉴别EV-E和EV-F病毒的方法,本研究根椐GenBank已发表的EV-E和EV-F肠道病毒的基因组序列,设计合成引物,建立了鉴别EV-E和EV-F的复合PCR方法,并确定了该方法的特异性、敏感性和重复性。同时,应用该方法检测吉林省长春地区疑似BEV感染样品。结果显示,建立的方法具有良好的特异性,只能检测出EV-E或EV-F肠道病毒,而牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒等病原检测均为阴性。敏感性试验结果显示,EV-E和EV-F最低检出量分别为3.67×10^(2),5.21×10^(3)拷贝/μL。检测长春地区的32份牛粪便样品的结果显示,EV-E和EV-F病毒的检出阳性率分别为28.13%和34.38%,两种病毒混合感染率为15.63%,与间接ELISA检测方法结果一致。上述结果表明,本试验建立的复合PCR方法具有特异性强,灵敏度高、快速与简便等特点,可用于EV-E和EV-F两种肠道病毒的鉴别诊断及流行病学调查。

检测猪瘟病毒E0抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

应用RT-PCR技术扩增了猪瘟病毒的E0基因片段,并将其分别克隆到pGEX-4T-1与pET-28a载体,获得了pGEX-4T-1-E0与pET-28a-E0重组表达质粒。以IPTG诱导表达的纯化GST-E0和His-E0重组蛋白为包被抗原,建立检测猪瘟病毒E0抗体的间接ELISA方法。采用方阵滴定法,确定出GST-E0抗原和His-E0抗原的最佳包被量分别为50ng/孔和100ng/孔,血清最佳稀释度为160倍。对80份猪瘟阴性血清样品进行了检测与统计学分析,确定出GST-E0和His-E0重组蛋白的间接ELISA方法的临界值分别为0.167和0.176。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,本试验建立的基于GST-E0和His-E0蛋白的间接ELISA方法均具有特异、敏感和重复性好等优点。应用GST-E0和His-E0的间接ELISA方法及IDEXX E2抗体检测试剂盒平行检测88份猪血清样品,结果显示基于GST-E0和His-E0的间接ELISA方法与IDEXX试剂盒的符合率分别为78.41%和84.09%。以猪瘟病毒接毒细胞为抗原,应用免疫荧光试验(IFA)对His-E0间接ELISA和IDEXX检测试剂盒检出的阴性与阳性血清样品进行了验证,结果IFA与His-E0间接ELISA方法的符合率为93.18%;IFA与IDEXX试剂盒的符合率为90.91%,表明本试验所建立的基于His-E0的间接ELISA方法用于检测猪瘟抗体优于IDEXX公司检测E2抗体的试剂盒。该方法为鉴别E2亚单位疫苗免疫后的猪群中是否存在野毒感染提供了技术手段。

新疆地区牛肠道病毒的病毒分离鉴定及毒株差异

牛肠道病毒感染是由牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV)引起的一种临床上以呼吸系统、消化系统和神经系统症状为主要特征的传染病。作为国内新发传染病,该病在新疆地区牛群的感染情况缺乏研究。本研究应用双抗体夹心ELISA方法对采集于新疆不同区域牛群的740份牛粪样品进行BEV抗原检测,并进行了病毒的分离鉴定及遗传进化分析。结果显示,新疆不同地区牛群均存在程度不同的BEV感染,感染率为7.8%~24.3%。应用Vero细胞从部分阳性样品中分离获得了3株病毒,理化学特性、生物学特性及免疫学特性鉴定结果显示,分离的3株病毒均为肠道病毒,命名为BEV-XJY48、BEV-XJZ97和BEV-XJS128。分离毒株的5′UTR基因序列测定与遗传进化分析显示,3株BEV毒株均为E种肠道病毒。本研究结果揭示出新疆不同地区牛群存在BEV感染,丰富了国内BEV感染的流行病学资料,为今后新疆地区该病的防控提供了理论依据。

检测F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

依据F种肠道病毒(enterovirus species F,EV-F)SD-S67毒株的基因组序列设计合成引物,RT-PCR扩增出该毒株的VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的BamHⅠ/EcoRⅠ位点,表达出VP1重组蛋白。以纯化VP1重组蛋白为免疫原,制备兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立了检测F种肠道病毒的双抗体夹心ELISA方法,同时对山东和河南省部分地区牛群感染EV-F进行了初步的流行病学调查。结果显示,捕获抗体的最佳包被量为400 ng/孔,HRP酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶400;确定的方法判断标准为样品的D_(490)>0.217时判定为阳性。建立的ELISA方法可以特异性检测出EV-F病毒抗原,而EV-E和BVDV病毒抗原检测结果均为阴性,表明方法具有较好的特异性。以建立的ELISA方法检测不同稀释倍数的阳性样品,结果稀释1000倍后的样品检测结果仍为阳性,表明建立的方法具有较高的敏感性。应用建立的方法检测部分样品,组内变异系数为1.05%~9.24%,组间变异系数为1.39%~6.78%,说明该方法具有良好的重复性。同时部分样品的ELISA和PCR方法的检测结果显示,两者的符合率为100%。以该方法对山东、河南两地牛群样品进行检测,结果显示牛群的EV-F的感染率分别为12%和8%。结果表明,建立的F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法具有较高的特异性、敏感性,且快速简便,可用于F种肠道病毒感染的诊断与流行病学调查。

牛、羊新发肠道病毒的发现及病毒准种进化与感染模型的研究

牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)和羊肠道病毒(Caprine/ovine enterovirus,CEV)感染是近年来国内牛群和羊群中暴发流行的一种由肠道病毒(Enterovirus,EV)引起的临床上以严重腹泻、呼吸困难、发病率与致死率高达50%为主要特征的新发传染病,给养殖业造成了比较严重的经济损失.肠道病毒属于小RNA病毒科、肠道病毒属中的成员,病毒粒子呈球形,无囊膜,直径约30,nm.项目针对国内近年来牛场、羊场暴发的新发疫病,开展了病原的分离及鉴定、病毒感染模型、病毒反向遗传操作平台及病毒变异与进化等方面的系统研究,率先在国际上分离与鉴定出山羊肠道病毒CEV-JL14毒株.该病毒株的成功分离与鉴定,确定了国内羊群中存在尚未报道的肠道病毒感染,目前CEV-JL14毒株已被国际病毒分类委员会(ICTV)列为EV-G20的标准(参考)毒株.在国内率先分离鉴定出E种肠道病毒HY12毒株,解析出其完整基因组序列.HY12毒株也是目前在国际上其完整基因组被破译的罕见EV-E3毒株,为系统研究E种肠道病毒的致病机理、遗传变异、检测技术及防控奠定了坚实的基础及提供了参考毒株.同时,项目建立了肠道病毒小鼠感染模型和肠道病毒反向遗传操作平台,确定出外源序列插入HY12病毒基因的关键位点及拯救出HA标签抗原的嵌合HY12病毒,发现HY12毒株以准种形式存在,阐明HY12病毒的遗传变异与进化规律等,为研究病毒的致病机理及肠道病毒的重组等研究奠定了基础.