转牛Myf6基因小鼠脾脏功能的研究

为了研究外源基因转入对动物免疫功能的影响,即转牛Myf6基因小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力以及相关细胞因子IL-2、IFN-γmRNA表达的变化,试验随机选择5只转牛Myf6基因的子一代小鼠,采用MTT法体外检测脾淋巴细胞增殖能力和实时荧光定量PCR研究宿主脾脏中的IL-2mRNA、IFN-γmRNA表达变化。结果表明:Myf6子一代小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖指数与阴性对照组相比显著降低,IL-2 mRNA相对表达量显著降低,IFN-γmRNA表达也出现了显著下降。说明外源基因Myf6转入抑制了小鼠的脾脏免疫机能。

鸡肠道枯草芽孢杆菌的分离鉴定及生物特性研究

为研究和开发动物新型微生态制剂,最大程度的提高经济效益,改变抗生素滥用、药物残留等现状,从健康鸡肠道中分离出1株芽孢杆菌,并命名为W,且对其进行形态观察、生化试验鉴定和16S rRNA序列分析及同源性比较。结果表明,本菌株与Bacillus subtilis strain CICC 10023(GU980947.1)的同源性达99.5%,最终确定该菌株为枯草芽孢杆菌,对该菌株进行药敏试验和安全性试验。结果表明,该菌对青霉素、杆菌肽耐药,对小鼠无致病性。

转基因动物细胞中外源基因整合位点的分析

旨在通过测定转基因动物中外源基因在宿主染色体上的整合位点来阐述外源基因的整合机制及对该过程中出现的有关问题进行讨论。本研究以MYF6(Myogenic factor 6)转基因小鼠及FAT-1转基因牛为试验材料,采用TAIL-PCR(热不对称交互式PCR)、hiT AIL-PCR(高效热不对称交互式PCR)及本试验室改进的hiT AIL-PCR法,对转基因动物进行了外源基因的整合位点的检测及测序分析。本研究检测到3个MYF6转基因小鼠和一个FAT-1转基因牛的外源基因插入到染色体上的片段,还获得了大量的未能整合到染色体上的PCR片段。通过对以上片段的测序分析,我们发现重组质粒并不一定是在酶切位点断裂,重组质粒可以发生随机断裂,首尾相连等,外源基因整合如宿主染色体,可以同源重组的方式进行整合,也可以进行随机插入。同时,发现并分析了在转基因动物检测中可能存在的问题。通过对外源基因在转基因动物体内整合位点的分析,能够明确转基因动物的遗传背景,能够为转基因动物的生产提供帮助。

转MSTN干扰载体细胞株的获得及外源基因整合情况的研究

转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime PCR和高效热不对称互交式PCR(hiTAIL-PCR)技术检测细胞克隆中MSTN表达载体的拷贝数及其在牛基因组中的整合位点。结果表明,荧光定量PCR有效检测到5个细胞克隆中质粒的拷贝数分别为2.26±0.32、1.52±0.25、25.68±1.02、8.43±0.73和6.72±0.10。hiTAIL-PCR对整合位点的检测结果表明,质粒片段在插入到基因组的过程中进行了重组,其与基因组的结点处有2或4个共同的碱基序列。该研究探索MSTN干扰载体在牛胎儿成纤维细胞中的整合机制,以期获得遗传背景清楚的转基因细胞作为体细胞核移植的重要材料,为高产转基因肉牛新品种的培育提供重要的理论和实验基础。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsYUCCA1基因突变体

为研究植物激素生长素在模式作物水稻中的功能,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,设计水稻生长素合成基因Os YUCCA1的两个靶位点,构建Os YUCCA1基因的敲除载体。通过对Os YUCCA1基因序列分析,将合成的靶点序列插入含hsp Cas9n的载体中,再与p CAMBIA1300重组,构建基因编辑载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻品种9522。从78棵转基因苗中鉴定得到针对Os YUCCA1的3种突变类型,包括26棵在外显子第260号碱基处插入碱基A或T两种类型纯合突变和22棵在外显子第447号碱基处插入A、444号碱基C被T替换、445号碱基G被C替换的杂合突变类型。通过分析,发现3种突变株系都存在移码现象而使氨基酸提前终止致使基因突变。本研究成功利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除了水稻Os YUCCA1基因,为进一步研究Os YUCCA1基因功能提供了理论参考依据。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻osarf8-1杂合突变体

为了研究生长素是如何参与调控植物的生长发育过程,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,设计水稻生长素响应因子OsARF8的两个靶点,对水稻中的该基因进行敲除。构建基因编辑载体pBIN-sg R-Cas-Os,通过农杆菌介导转化水稻品种‘9522’。我们从潮霉素抗性筛选出的28株转基因植株中鉴定得到针对OsARF8的一种杂合突变类型,共计6棵在外显子第174号碱基处缺失一个C碱基的杂合突变类型osarf8-1,该处碱基突变所对应的是第7个氨基酸的变化,导致亮氨酸(Leu)变成色氨酸(Trp),自此处开始随后的氨基酸序列发生移码突变,并且提前终止于第123个氨基酸,正好位于Os ARF蛋白的DBD功能域的最始端(DBD为120~222个氨基酸),说明DBD功能域在该突变体中完全不能表达,ARF8蛋白的功能将受到极大的影响。本研究成功利用CRISPR-Cas9基因编辑技术精确地敲除了水稻OsARF8基因,为CRISPR技术在水稻中的应用提供了一个可供参考的范例,同时也为进一步研究OsARF8基因功能提供了重要的参考依据。