AtDME1化学诱导表达载体的构建及其瞬时表达

以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明,较低浓度的17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-DME1中目的基因的表达,诱导处理后目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高,之后缓慢下降。该载体的成功构建为深入研究DNA去甲基化与植物的生殖发育调控奠定了基础。

早实核桃体细胞胚发生和植株再生的影响因素研究

[目的]建立2种早实核桃高效和稳定的体胚发生体系,为离体快繁技术及其基础研究提供技术和理论支撑,也为核桃遗传转化体系的构建奠定基础。[方法]分别以实生核桃‘林早香’和嫁接核桃‘中林6号’花后4277d的幼胚为试材进行离体培养,通过统计体胚诱导率,筛选体胚的最佳诱导时期;统计多次继代的体胚畸变率,并筛选最适ABA调节浓度;选取发育成熟的体胚进行饱和NH4NO3溶液脱水处理,分别处理0、24、48、72、96和120h后统计失水量和转株率,探讨脱水程度对体胚植株再生的影响。[结果]外植体的发育时期对体胚发生至关重要,以‘林早香’和‘中林6号’幼胚为外植体进行体胚诱导,最佳诱导时期分别为花后约49d和56d,体胚诱导率分别为88.32%和86.67%。体胚经多次继代培养后产生较高畸变率,适量ABA处理不仅降低体胚畸变率,且提高体胚发生率,最佳ABA调节浓度为1.0mg·L^-1。随着体胚脱水时间的延长,体胚失水量逐渐增加,植株再生率先升高后降低,脱水72h时,‘林早香’和‘中林6号’的体胚萌发率达到最高,分别为56.67%和53.33%,此时失水量分别为38.73%和40.56%。[结论]早实核桃幼果发育过程中,合子胚的体胚发生率随着发育时期变化,适宜发育时期是提高体胚诱导发生的关键;适量ABA在体胚多次继代培养过程中对畸形胚起重要调节作用;适度的脱水处理对核桃体胚再生具有良好的促进作用。

转多基因1年生库安托杨对溃疡病的抗性分析

[目的]本研究对转多基因库安托杨株系的溃疡病抗病性检测及抗病相关基因的表达分析,为通过基因工程手段培育抗病林木新树种提供有价值的参考。[方法]以转JERF36等多个外源基因的1年生库安托杨株系D5-9、D5-20、D5-21及非转基因受体D5-0为材料,对主干人工接种溃疡病菌的各株系病情指数进行了测定,同时对接种5 d后树皮组织中5个抗病基因的表达情况进行了实时定量PCR(qPCR)分析。[结果]在溃疡病菌胁迫下,3个转基因株系对溃疡病菌的抗性显著优于非转基因受体株系,转基因株系间抗病性也具有一定差异,D5-21的病情指数显著低于其它2个转基因株系;肉桂醇脱氢酶基因在3个转基因株系树皮中表达量均高于对照,类甜蛋白基因仅在D5-19树皮中的表达量高于对照,其他3个基因在转基因株系中的表达量或与对照相当或低于对照。[结论]转多基因库安托杨株系的溃疡病抗性与非转基因对照相比均有显著提高,且转基因株系间差异显著;同时转基因株系中不同抗病基因的表达模式也有很大差异,说明溃疡病菌胁迫下转多基因库安托杨抗病调控的复杂性,其分子调控机制还有待深入研究。

去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达

植物去甲基化酶ROS1是表观遗传中一种重要的作用因子,参与基因的表达调控,与植物的生长发育及各种逆境响应过程密切相关。以拟南芥AtROS1基因为目的基因,采用"酶切—连接"的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-ROS1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明:17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-ROS1中目的基因的表达,17-β-雌二醇最佳诱导浓度为50~100μmol·L^(-1);随着诱导时间的延长,目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高。该诱导表达载体的构建为研究植物抗逆胁迫过程中的表观遗传机制奠定了基础。

复幼促进核桃不定根发生的DNA甲基化机制探讨

该研究以核桃的复幼和成龄插穗为材料,通过甲基化修饰依赖性内切酶测序技术(MethylRAD-Seq),在全基因组水平上检测成龄与复幼插穗中DNA甲基化位点分布特征,进一步对复幼处理前后插穗中差异甲基化位点相关基因的表达情况进行分析。结果显示:(1)复幼处理可显著降低核桃插穗的DNA甲基化水平。(2)功能富集分析结果显示,差异甲基化位点相关基因主要参与油菜素内酯信号转导、次级代谢产物生物合成和木质素生物合成等功能,参与光合作用、MAPK(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、果糖和甘露糖代谢、cAMP(cyclic AMP,CAMP)信号途径和苯丙烷生物合成等代谢通路。(3)qRT-PCR分析结果显示,复幼处理前后,不定根发生的关键调控基因NAC1、ARF5、ARF6和WRKY22在复幼和成龄材料中具有不同的表达模式。研究认为,复幼处理降低了核桃插穗中基因组DNA的甲基化水平,进而影响不定根发生过程关键功能基因的表达,可能是复幼调控核桃不定根发生能力的重要途径。

NSCLC放化疗前后血清CEA、CA12-5、CYFRA21-1变化及临床意义

目的观察Ⅲ期非小细胞肺癌同步放化疗前后血清CEA、CA125、CYFRA21-1的表达情况。方法采用电化学发光免疫学测定方法检测40例Ⅲ期非小细胞肺癌患者同步放化疗前后外周血清中CEA、CA125、CYFRA21-1的表达水平。结果同步放化疗前腺癌组外周血清中CEA表达明显高于鳞癌组;鳞癌组外周血清中CA125和CYFRA21-1表达高于腺癌组,同步放化疗后CEA、CA125、CYFRA21-1的表达较前下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Ⅲ期非小细胞肺癌同步放化疗前后血清中CEA、CA125、CYFRA21-1的表达水平可作为其疗效判定的指标。

基于LabVIEW的包装六面体跌落方位控制研究

对跌落方位的控制是跌落试验机自动控制技术的核心,目前大多采用人为固定跌落方位。为了降低操作复杂程度和人为误差等因素的影响,设计了一种基于虚拟仪器LabVIEW的包装六面体棱跌落的控制方案。方案采用梁式测力传感器将测得的信号通过数据采集卡传输到主机端,然后用LabVIEW软件对采集的数据进行实时显示、监测与控制。

哈萨克族食管癌患者外周血IDO检测的临床意义

目的探讨哈萨克族食管癌患者外周血中吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的表达水平及其与食管癌临床病理特征的关系。方法用RT-PCR法检测50例哈萨克族食管癌患者治疗前外周血、20例正常人外周血中IDOmRNA的表达情况。结果 IDOmRNA在食管癌患者外周血中的表达为(1.836±0.583)×103,显著高于正常人的(0.145±0.024)×103(P<0.05);食管癌外周血中IDOmRNA的表达与肿瘤的临床分期和淋巴结转移有关(P<0.05);年龄、性别以及肿瘤的生长部位与IDOmRNA的表达无关(P>0.05)。结论 IDOmRNA在新疆哈萨克族食管癌患者外周血中存在高表达,其表达程度与食管癌的发生,发展和转移有着密切的关系。

核桃JrGA2ox基因的克隆、亚细胞定位及功能验证

【目的】GA2-oxidase(GA2ox)是赤霉素合成过程中起负调控作用的一种关键酶,能够催化有活性的赤霉素为无活性的赤霉素,从而对植物生长起到一定的抑制作用。本研究主要对核桃中赤霉素氧化酶基因JrGA2ox进行克隆及功能验证,有利于进一步探究核桃JrGA2ox基因在植物生长和发育过程中,尤其是在植物株高调控中的作用,从而助力于挖掘与利用核桃中更多的优质基因,培育出更多优良的核桃品种。【方法】采用PCR扩增技术,克隆获得核桃JrGA2ox基因的全长编码序列,进一步通过In-Fusion克隆技术构建具有强启动子的35S∷JrGA2ox∷GFP过表达载体;利用BLAST网络在线工具得到其他植物中的JrGA2ox同源氨基酸序列,并对其进行氨基酸同源序列比对和系统进化分析;其后,通过亚细胞定位揭示其发挥功能的场所,进一步利用农杆菌介导法将构建好的过表达载体转化到核桃体细胞胚中,获得JrGA2ox超表达的阳性转化植株,深入分析JrGA2ox基因的生物学特性。【结果】通过基因克隆,得到1条JrGA2ox开放阅读框,其全长为1 056 bp,共编码351个氨基酸,分子量为39.25 kDa。通过比对发现,该基因编码的蛋白序列含有保守2OG-FeII-Oxy蛋白结构域,具有GA2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点,表明JrGA2ox属于GA2-氧化酶基因家族。氨基酸进化树比对分析结果显示,核桃JrGA2ox与毛白杨PtGA2ox聚为一个分支。且JrGA2ox蛋白与木本植物川桑MnGA2ox1、西洋梨PcGA2ox、桃PpGA2ox1及苹果MdGA2ox1蛋白序列同源性较高。烟草叶片表皮细胞亚细胞定位分析表明,JrGA2ox是定位于细胞核与细胞膜中的蛋白。对核桃体细胞胚进行基因遗传转化后经荧光检测及PCR验证表明,35S∷JrGA2ox∷GFP过表达载体被成功转入核桃体细胞胚中。阳性再生植株株高与对照苗相比具显著性差异,其平均株高为对照植株的1/2;且其株高与JrGA2ox基因表达量呈负相关。【结论】核桃JrGA2ox蛋白亚细胞定位于细胞核与细胞膜中。JrGA2ox基因调控核桃株高,主要起到负调节作用。阳性基因转化再生植株中JrGA2ox基因的表达量升高,并表现出明显的矮化特征。本研究结果可为进一步分析该基因在核桃生长发育过程中的作用提供技术参考,且为优良的矮化核桃品种选育奠定一定的基础。

核桃芽接愈合的组织学机制

【目的】通过对核桃芽接愈合过程的组织学观察,研究不同嫁接时期砧穗在愈伤组织形成、增殖和输导组织连接过程中的组织学变化机制,旨在为核桃和其他木本植物嫁接提供理论指导。【方法】以12年生核桃品种‘香玲’半木质化新梢中部芽片为接穗,2年生本地核桃实生苗为砧木,采用方块芽接法分别于砧木萌芽后40~47天和100~107天2个时间进行芽接试验,采用本课题组建立的非均质化材料切片方法对芽接愈合过程进行组织学观察。【结果】核桃萌芽后40~47天的砧穗愈合方式与前人报道一致,即形成层细胞在嫁接体愈合过程中起主导作用,愈合过程中主要组织学变化包括:隔离层的产生(3天)→砧穗形成层细胞分化产生愈伤组织(4天)→愈伤组织连接(6天)→砧穗原有形成层的修复与连接(12天),完成愈合需要12~15天,成活率达95.6%。而在萌芽后100~107天的砧穗愈合过程中,发现了与上述常规愈合不同的嫁接愈合新方式。此过程中木射线细胞起主导作用,愈合过程依次历经隔离层的产生(3天)→木射线细胞分化产生愈伤组织(4天)→砧穗愈伤组织连接(9天)→导管分化形成(15天)→新的形成层产生以及木射线的连接(25天),需要25~30天才能完成愈合,成活率为61.7%;在木射线细胞主导的砧穗愈合过程中砧木一侧的隔离层要先于接穗发生溶解,在砧穗愈伤组织完成连接时消失,而接穗表面隔离层在愈伤组织分化时依然存在,直至新的形成层产生后才完全溶解消失。【结论】核桃芽接过程中,除了常见的由形成层细胞主导的砧穗愈合方式外,还存在由木射线细胞主导的砧穗木质部的愈合新方式,木射线细胞脱分化产生愈伤组织,并进一步分化出导管、形成层和木射线等组织完成最终的砧穗连接;在此过程中愈伤组织主要来自于砧木木射线细胞且砧木隔离层要先于接穗发生溶解。

欧洲黑杨‘N46’组培再生体系的建立

以欧洲黑杨N46无性系(Populus nigra‘N46’)的腋芽无菌萌发的幼嫩叶片为试验材料,对影响其不定芽分化和生根的关键因子进行了研究,建立了高效稳定的不定芽诱导和植株再生体系。结果表明:欧洲黑杨N46无性系幼嫩叶片进行不定芽分化诱导的最适培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA0.03 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂粉5 g·L-1,诱导最佳温度为27℃,每个叶片平均分化不定芽数量可达45.20个;不定芽生根的最佳培养基为1/2MS+IBA0.01 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂粉5 g·L-1,生根最佳温度为25℃,生根率可达93.33%,生根小植株移栽成活率达98%。

AtMET1基因克隆及化学诱导表达分析

DNA甲基化是植物基因组中普遍存在的一种的重要表观遗传学机制,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用[1-2]。植物体DNA甲基化的建立和维持受多个基因的协同调控,其中MET1（DN-MT1-like METHYLTRANSFERASE 1 gene）是在植物中最早分离出来的甲基化相关基因,编码DNA甲基化转移酶1（MET1,Methytransferase1）,该酶主要负责保持CG位点的甲基化,通过DNA甲基化作用影响植物的基因组结构、发育和进化。

AtMET1基因在84K杨中的遗传转化及诱导表达分析

[目的]研究拟南芥甲基化转移酶基因AtMET 1在银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系、进而实现杨树品种改良等奠定基础。[方法]以白杨派优良品种84K杨的无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtMET1基因导入84K杨基因组中;经潮霉素筛选获得抗性植株,通过常规PCR检测、DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外源基因AtMET1表达量变化。[结果]本研究共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得18株抗性植株,经分子检测证实全部为转基因植株,分别标号为AM-1~18#。qRT-PCR结果显示:化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtMET1的表达量即达到最大值,随后在处理6 h时表达量下降,处理12 h时有所回升,处理24 h后表达量降低至不足12 h时的一半。[结论]化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtMET1基因的表达,为进一步研究MET1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为今后杨树化学诱导表达研究及品种改良提供新思路、新方法。

核桃JrWOX4b基因的克隆和功能分析

[目的]为探索WOX4b基因在核桃不定根发生过程中的调控作用提供理论支撑。[方法]以核桃品种‘林早香’(Juglans regia‘Linzaoxiang’)的cDNA为模板克隆该基因CDS全长序列;利用生物信息学技术对其进行多重序列比对和系统进化分析;构建该基因与黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein,YFP)标签的融合表达载体进行亚细胞定位分析;通过对银腺杨‘84K’的遗传转化,分析其功能。[结果]JrWOX4b基因的编码序列(Coding sequence,CDS)长度为678 bp,编码226个氨基酸,分子量为25.42 KDa。所编码氨基酸序列的多重比对及系统进化分析结果显示:核桃JrWOX4b与山核桃属的长山核桃同源蛋白遗传关系最近,与壳斗科栎属白栎次之,而与禾本科的黍稷和二穗短柄草的亲缘关系最远。JrWOX4b基因过表达植株的表型分析结果显示:JrWOX4b的过表达和对照植株生长发育均正常,但在相同培养条件下,JrWOX4b基因的过表达能够显著增加杨树的不定根数量,2周龄过表达植株不定根数量为对照植株的3~4倍,不定根长度是对照植株的1/2。[结论]从核桃中成功克隆了WOX基因家族成员JrWOX4b基因,其过表达可显著增加转基因植株的不定根数量。研究结果不仅能够为不定根发生调控机制的研究提供理论支撑,同时也为其他难生根木本植物的快速繁殖提供优良基因资源。

转AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

【目的】DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要作用。本研究将拟南芥去甲基化基因AtDME1导‘84K’杨基因组中,通过化学诱导表达实验,研究AtDME1基因在转基因杨树中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系,进而实现杨树品种改良等奠定良好基础。【方法】以白杨派优良品种84K杨无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtDME1基因导入‘84K’杨;经过潮霉素筛选、常规PCR检测及DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用qRT-PCR检测处理叶片中外源基因AtDME1的表达量变化。【结果】本研究中,潮霉素分化筛选共获得了抗性芽224个,经生根筛选获得6株抗性植株,经分子检测证实这6株抗性植株均为转AtDME1基因植株,扩繁后分别标号为转基因AD-1~6。qRT-PCR检测结果显示,化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtDME1的表达量基本达到最大值,效果持续至12 h后逐渐减弱。【结论】化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtDME1基因的表达,为进一步研究DME1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为杨树化学诱导表达特性的研究做好了铺垫。

阿帕替尼联合NP化疗治疗晚期非小细胞肺癌疗效及对患者血清肿瘤标志物和生存质量的影响

目的:探讨阿帕替尼联合NP化疗治疗晚期非小细胞肺癌疗效及对患者血清肿瘤标志物和生存质量影响。方法:晚期非小细胞肺癌患者113例随机分为观察组57例与对照组56例。对照组患者采用NP化疗方案治疗,观察组在对照组基础上加用阿帕替尼治疗。两组疗程均为4个化疗周期,每个周期28 d。比较两组近期疗效、生活质量改善和不良反应发生情况,及治疗前后血清肿瘤标志物变化。结果:观察组总有效率为56.14%,生存质量提高率为71.93%,均明显高于对照组(P<0.05)。两组治疗后血清癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)水平均较治疗前明显降低(P<0.05),且观察组低于对照组(P<0.05)。两组不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:晚期非小细胞肺癌患者应用阿帕替尼联合NP化疗治疗疗效明显,且可降低血清肿瘤标志物CA125、CEA和CYFRA21-1水平及提高患者生存质量,值得临床借鉴。

AHP法在水利工程设计方案优选中的应用

以水利工程中某水库除险加固为例,采用层次分析法(AHP)对工程存在的风险进行分析。根据模型中各层次因素的相对重要性差异,定量表示客观现实情况,通过计算确定每一层次全部因素相对重要性权值,得到了各方案相对最高层目标的重要性次序组合权值,为定性问题的定量解决提供了理论依据和方法。计算结果表明:应用AHP法确定方案二最优。

LncRNA SNHG7在肝癌组织中的表达水平及临床意义

目的探讨长链非编码RNA (lncRNA)SNHG7在肝细胞癌(HCC)组织中的表达水平及其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测HCC组织及细胞系和正常肝组织及细胞系中的SNHG7的表达并与临床病理因素对比。用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,Cox比例风险回归模型进行单因素及多因素分析。结果 SNHG7在HCC组织和细胞系中的表达明显高于正常肝组织和细胞系,其表达与肿瘤TNM分期、肿瘤数目及肿瘤微血管侵犯密切相关;生存分析表明SNHG7高表达提示HCC患者低无瘤生存率和总体生存率;单因素和多因素分析表明SNHG7表达是影响HCC患者预后的独立危险因素。结论 SNHG7在HCC中高表达,其表达与肿瘤的进展情况及不良预后相关。

关于化工机械设备的维修保养技术探析

经济的快速发展离不开化工机械设备的运用,机械设备的好坏直接就导致了较多数化工产品的好坏以及收益,因此,在化工生产中尤其重要的就是机械设备的管理和维修保养技术。这篇文章主要就是从化工机械设备以及维修保养技术这个角度进行解析。

“6s”管理在企业管理中的应用

文章从陕西延长石油(集团)有限责任公司榆林炼油厂“6s管理”实际出发,就实施“6s管理”的管控措施、实施技巧、成效等方面进行了描述,阐述说明了企业推进“6s管理”的重要性和必要性。