粉葛水提物对2型糖尿病db/db小鼠胰岛细胞炎症损伤的改善作用及其机制

为探讨粉葛水提物对2型糖尿病db/db小鼠胰岛细胞炎症损伤的作用及机制,将30只db/db小鼠随机分为模型组、粉葛水提物高、中、低剂量组和二甲双胍组,正常组则采用6只db/m小鼠。持续给药8周后,测量小鼠体质量变化、计算胰重比、检测血清空腹胰岛素(fasting serum lisulin,FINS)、血清空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血清蛋白(glycosylated serum protein,GSP),计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assess-ment for insulin resistance,HOMA-IR);苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察胰腺组织病理学变化;免疫组化(immunohistochemistry,IHC)法检测胰岛细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、核因子-κBp65(nuclear factor kappa-Bp65,NF-κBp65)和白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的蛋白表达;蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测胰腺组织寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(cystein-asparate protease 1,caspase-1)、白细胞介素1β(interle-ukin-1β,IL-1β)、IL-18的蛋白表达;免疫荧光(immunofluorescence,IF)法检测胰腺组织NLRP3的表达。结果表明:与正常组比较,模型组小鼠体质量、胰重比、血清GSP、FBG、FINS含量、HOMA-IR水平明显增加;胰岛细胞变形,出现炎性浸润,胰岛细胞和腺泡细胞边界不清晰,TNF-α、NF-κBp65和IL-18的蛋白表达量明显增加;胰腺组织中相关蛋白表达量明显升高。与模型组比较,二甲双胍和粉葛水提物组体质量、胰重比、血清GSP、FBG、FINS明显降低;胰岛细胞形态完整且边界清晰,炎性浸润明显降低,可见较多胰岛细胞,TNF-α、NF-κBp65和IL-18的蛋白表达量明显减少;胰腺组织中相关蛋白表达量明显降低。综上,粉葛水提物可以减轻db/db小鼠胰岛细胞的炎症损伤,降低胰岛素抵抗,改善2型糖尿病症状。其作用机制可能与抑制NLRP3炎性小体通路及其下游炎症因子IL-1β和IL-18的分泌有关。

大豆苷元通过调控NLRP3炎性小体信号通路对高糖诱导的巨噬细胞炎症损伤的影响及机制研究

探究大豆苷元(daidxein)调控NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)信号通路对高糖诱导的巨噬细胞炎症反应的抑制作用。cell counting kit(CCK)-8法检测不同浓度大豆苷元对巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响,Western blot法检测不同时间和葡萄糖浓度下巨噬细胞的肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白表达水平,以及高糖诱导下巨噬细胞极化、Toll样受体4(TLR4)-髓分化因子88(MyD88)-NLRP3炎性小体等通路相关蛋白的表达水平,酶联免疫检测试剂盒(ELISA)检测巨噬细胞分泌的TNF-α、白细胞介素(IL)-18、IL-1β炎症因子的表达情况,免疫荧光检测经高糖诱导下的巨噬细胞中细胞核因子(NF)-κB p65的表达水平,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的表达情况,qRT-PCR检测巨噬细胞中NLRP3、TNF-α和IL-18 mRNA水平。结果发现,选用30 mmol·L^(-1)葡萄糖浓度诱导48 h可作为巨噬细胞损伤的最佳造模条件;与正常组相比,模型组可以显著改善巨噬细胞极化,增加TNF-α、IL-18、IL-1β炎症因子的分泌,显著增加ROS及NF-κB p65的表达,模型组巨噬细胞NLRP3、TNF-α和IL-18 mRNA与TLR4、MyD88、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NF-κB抑制因子(I-κB)、p-I-κB、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶前体(pro-caspase)-1、pro-IL-1β、cleaved IL-1β和pro-IL-18蛋白表达均显著升高;与模型组相比,大豆苷元10、20、40μmol·L^(-1)剂量组中巨噬细胞各炎症因子,炎症相关基因NLRP3、TNF-α和IL-18 mRNA,炎症相关蛋白TLR4、MyD88、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65、I-κB、p-I-κB、ASC、pro-caspase-1、pro-IL-1β、cleaved IL-1β和pro-IL-18表达水平均显著下调,且ROS的表达明显降低。基于相关文献报道结合该实验结果发现,高糖可诱导巨噬细胞极化,促进炎症因子的分泌,大豆苷元能通过调节NLRP3炎症小体信号通路,抑制巨噬细胞ROS的表达从而减轻高糖诱导的巨噬细胞炎症反应。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制。方法:本实验通过采用不同浓度(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 mg·L^(-1))脂多糖(LPS)对RAW264.7巨噬细胞干预24 h,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适浓度建立体外LPS诱导RAW246.7巨噬细胞炎症模型。将实验分为空白组(20%空白血清),模型组(20%空白血清+10 mg·L^(-1)LPS),模型对照组(20%FBS+10mg·L^(-1)LPS),低、中、高(5%、10%、20%)补阳还五汤含药血清组及NLRP3抑制剂MCC950(50μmol·L^(-1))、活性氧(ROS)抑制剂NAC(10μmol·L^(-1))、NF-κB抑制剂PDTC(10μmol·L^(-1))联合补阳还五汤高剂量(20%)组。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况;流式细胞术检测巨噬细胞ROS水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测M1型巨噬细胞相关细胞因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、M2型巨噬细胞相关细胞因子精氨酸酶1(Arg-1)、白细胞介素-10(IL-10)蛋白表达,TLR4/NF-κB/NLRP3通路的相关蛋白表达。结果:CCK-8结果显示,在10 mg·L^(-1)LPS的刺激下,RAW264.7巨噬细胞的细胞活力值最高(P<0.01)。与空白组比较,模型组IL-1β、IL-18、TNF-α水平显著升高(P<0.01);ROS表达量显著上升(P<0.01);M1型巨噬细胞iNOS、TNF-α蛋白表达显著升高(P<0.01),M2型巨噬细胞Arg-1、IL-10蛋白表达显著降低(P<0.01);TLR4、髓样分化因子88(Myd88)、磷酸化核转录因子-κB抑制蛋白(p-IκB)/核转录因子-κB抑制蛋白(IκB)、磷酸化核转录因子-κB(p-NF-κB)p65/NF-κB p65、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1前体(pro-Caspase-1)蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,补阳还五汤各给药组及抑制剂组均可明显降低IL-1β、IL-18、TNF-α水平(P<0.05,P<0.01),抑制RWA264.7巨噬细胞炎症因子的表达;降低细胞ROS表达水平(P<0.01);下调M1型巨噬细胞iNOS、TNF-α蛋白(P<0.01),上调M2型巨噬细胞Arg-1、IL-10蛋白表达(P<0.05,P<0.01);降低TLR4、Myd88、p-IκB/IκB、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:补阳还五汤可改善巨噬细胞炎症反应,可能与降低巨噬细胞ROS水平,抑制RAW264.7巨噬细胞极化,下调TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达水平有关。

基于肠道菌群分析探讨葛根减轻T2DM db/db小鼠胰岛素抵抗的作用及机制

基于肠道菌群分析探讨葛根对2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)db/db小鼠胰岛素抵抗的作用及可能机制。将50只db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组以及葛根高、中、低剂量组,另取10只db/m小鼠为正常组。持续给药8周,测量小鼠体质量和血糖;酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测糖化血清蛋白(glycosylated serum protein,GSP)、血清空腹胰岛素(fasting serum lisulin,FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色观察胰腺组织病理学变化;免疫组化检测胰腺肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达;16S rRNA技术检测正常组、模型组和葛根中剂量组小鼠粪便肠道菌群结构变化;蛋白免疫印记法检测回肠组织中法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)、G蛋白胆汁酸偶联受体5(takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5),肝组织中胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)、甾醇27α-羟化酶(sterol 27α-hydroxylase,CYP27A1)和结肠组织中G蛋白偶联受体41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)、G蛋白偶联受体43(G protein-coupled receptor 43,GPR43)的表达。与正常组比较,模型组小鼠体质量、血糖、血清GSP、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、FINS显著增加,HOMA-IR指数显著上升;胰岛细胞炎性浸润,大量腺泡细胞坏死变性,胰岛细胞和腺泡细胞边界不清晰;肠道菌群发生紊乱;组织中FXR、TGR5、CYP7A1、CYP27A1、GPR41和GPR43蛋白表达显著降低。与模型组比较,二甲双胍组、葛根组小鼠体质量、血糖、血清GSP、FBG、FINS显著降低;胰岛细胞形态完整呈团状边界清晰,少量腺泡细胞坏死,可见较多胰岛细胞;葛根中剂量组肠道菌群从门到属水平均发生了变化,影响肠道菌群代谢物的菌群相对丰度增加;组织中FXR、TGR5、CYP7A1、CYP27A1、GPR41和GPR43蛋白表达显著升高。综合实验结果发现,葛根可改善T2DM db/db小鼠胰岛细胞的炎症损伤,减轻胰岛素抵抗,其作用机制可能与增加肠道中放线菌门、双歧杆菌、拟杆菌属丰度和肠道菌群代谢物相关蛋白表达有关。