HBV相关分泌蛋白c18orf54的克隆表达及初步功能研究

目的体外原核表达C18ORF54的重组蛋白,对其进行纯化,制备兔抗C18ORF54蛋白多克隆抗体,并对该重组蛋白对HepG2细胞可能的生物学作用进行初步研究。方法应用反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术,以HepG2细胞总RNA为模板,反转录并扩增c18orf54目的基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-c18orf54。转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖(isopropylβD thiogalacttpy ranoside,IPTG)诱导并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gol electrophoresis,SDS-PAGE)分析、免疫印迹(Western blotting)、生物质谱技术分析证实c18orf54重组蛋白表达正确。用Ni+亲和柱纯化表达蛋白。C18ORF54重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗c18orf54蛋白的多克隆抗体。以纯化的C18ORF54蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blotting和酶联免疫吸附(enzyine linked immunosorbent assay,ELISA)法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。将不同浓度范围的C18ORF54重组蛋白与培养的HepG2细胞共孵育,初步了解该重组蛋白对HepG2细胞可能的生物学作用。结果 PCR法扩增获得c18orf54基因片段,成功表达了C18ORF54重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting分析得到证实。成功获得重组蛋白及抗C18ORF54多克隆抗体。ELISA检测证实多克隆抗体效价>1∶320 000。结论利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达C18ORF54蛋白,获得高特异性、高效价兔抗C18ORF54重组蛋白的多克隆抗体,为今后研究C18ORF54蛋白的生物学特性奠定了基础。

蛋白质糖基化修饰:新一代肝病靶标的分子基础

肝病糖生物学研究是新一代肝病分子诊断标志物及肝癌治疗分子靶点研究的热点领域。不同肝病过程中伴随着复杂的蛋白质N-糖基化和O-糖基化修饰,这些糖基化修饰的变化导致了一些蛋白质翻译后修饰的改变,因而有可能成为未来新的肝病诊断标志物。这些修饰聚糖改变的基础在于肝细胞内部糖基转移酶和糖苷酶活性的变化,因而,对糖基转移酶和糖苷酶活性调控也有可能成为新一代抗癌药物研发的靶点。针对血清蛋白N-糖组分析也已经成为肝癌、肝硬化诊断的新方法。这些进展预示着肝病糖生物学研究将迎来一个新的时代。

抗病毒治疗对失代偿期乙肝肝硬化患者预后的影响

目的观察抗病毒治疗对失代偿肝硬化患者生存时间及肝癌发生的影响。方法回顾性分析1998年1月~2009年12月,于北京地坛医院住院至少3次或3次以上的HBV感染相关的失代偿肝硬化患者,抗病毒治疗对其预后的影响。所有分析对象是在最后1次住院期间死亡的患者。其中男168例,女69例。237例患者中70例患者接受了连续6个月以上的抗病毒治疗。耐药检测采用PCR法扩增病毒聚合酶相应的基因片段,并进行测序分析。结果接受核苷类似物抗病毒治疗的70例患者生存时间（34.44±28.39）个月,显著长于未接受治疗的患者（27.12±24.29）个月。167例未接受抗病毒治疗的失代偿肝硬化患者中,最终60例死亡前被确诊为肝癌,发生率为35.93%（60/167）;而接受抗病毒治疗的70例患者中,20例死亡前被确诊为肝癌,肝癌发生率为28.57%（20/70）。两组比较无显著性差异（P=0.37）。治疗期间6例患者出现耐药,但未出现病情加重。结论核苷类似物对HBV感染失代偿肝硬化患者的治疗有助于延长患者的生存期,但不能降低肝癌的发生。

N-糖基化修饰蛋白gp73与肝硬化患者Child-Pugh的关系

目的评价N-糖基化修饰蛋白gp73的血清水平与肝硬化患者Child-Pugh之间的关系及其可能的临床意义。方法所观察的患者均为2009年1月~2010年10月在北京地坛医院门诊及住院肝硬化患者,所有患者均为HBsAg阳性。观察患者共610例,其中男性患者448例,年龄17~82岁,平均48岁;女性患者162例,年龄18~76岁,平均55岁。入组肝硬化患者的Child-Pugh分级主要依据血清白蛋白、总胆红素、凝血酶原活动度、腹水及肝性脑病评价等5项指标。血清gp73浓度采用ELISA法检测。结果伴随肝功能衰退,血清gp73水平也相应升高。血清gp73水平Child-Pugh为C级的患者（255.78 ng/mL±100.89 ng/mL）显著高于B级（203.30 ng/mL±99.15 ng/mL）和A级的患者（125.28 ng/mL±67.05 ng/mL）。血清gp73与白蛋白之间呈显著负相关（r=-0.52,P〈0.0001）。结论 HBV感染肝硬化患者血清gp73水平随肝功能恶化而升高。

功能未知基因C16orf68在不同肝细胞系内的表达特征

目的获取人基因C16orf68,构建原核表达载体,诱导重组蛋白的表达,制备兔抗C16orf68蛋白多克隆抗体,观察C16orf68在各细胞系的表达特征。方法用RT-PCR技术,从肝星状细胞系LX2的总RNA中获得编码C16orf68基因功能片段的cDNA,构建原核表达质粒pET-32a(+)-C16orf68,并导入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达重组的重组蛋白。利用Western blot技术、生物质谱技术对表达的C16orf68进行确认。利用纯化的C16orf68重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C16orf68蛋白的多克隆抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。利用Western blot技术观察C16orf68在多个细胞系的表达特征。结果扩增获得C16orf68基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列相一致,成功表达了C16orf68重组蛋白,经Western blot鉴定、生物质谱Q-TOF分析均显示表达正确。利用纯化后的重组蛋白,制备了兔抗人C16orf68多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价>1:320 000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好,Western blot结果显示各细胞系该蛋白主要表达于肝实质细胞。结论 C16orf68在肝脏主要表达于肝实质细胞,可能与肝细胞损伤相关。

FAM172A及其异构体重组蛋白对体外培养肝细胞增殖的影响

目的体外克隆人类基因FAM172A,构建其原核表达载体并诱导其重组蛋白的表达,制备兔抗FAM172A重组蛋白的多克隆抗体,观察其在不同细胞系的表达情况。观察FAM172A-1和FAM172A-3蛋白对L02细胞增殖的影响。方法利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及PCR技术,构建原核表达质粒pET-32a(+)-FAM172A-1和pET-32a(+)-FAM172A-3。诱导该基因不同异构体重组蛋白的表达,并通过蛋白质免疫印迹(Western blot)技术进行鉴定。纯化后的重组蛋白FAM172A-1和FAM172A-3与肝细胞L02细胞共孵育,观察不同浓度的重组蛋白对细胞增殖的影响。利用纯化后的FAM172A(异构体3)重组蛋白免疫大耳白兔,获得抗FAM172A-3蛋白的多克隆抗体,利用酶联免疫吸附法(ELISA)以及Western blot技术对获得的多克隆抗体进行效价分析及特异性检测。结果成功扩增获得FAM172A(异构体1、3)的基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列一致;成功表达FAM172A(异构体1、3)的重组蛋白,经过Western blot鉴定正确;纯化后的重组蛋白FAM172A(异构体1、3)与L02细胞共孵育结果发现,两者对L02细胞在一定浓度范围内均有促进细胞增殖的作用。所制备的兔抗人FAM172A-3重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测显示其效价可达1︰1 280 000,Western blot检测证实该多克隆抗体的特异性良好;Western blot分析显示,该蛋白在肝脏间质细胞和实质细胞均有一定程度的表达。结论 FAM172A蛋白在肝实质细胞及肝间质细胞均表达,且其重组蛋白可以促进L02细胞增殖,推测该基因可能与肝细胞损伤、肝纤维化以及肝细胞再生等发生机制有关。

抑制O-糖基化修饰促进乙型肝炎病毒的释放

目的探讨抑制O-糖基化修饰对乙型肝炎病毒颗粒组装的影响。方法采用O-糖基化修饰抑制剂Benzyl-α-GalNAc干预HepG2.2.15细胞。经7-AAD染色,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR方法检测上清HBV病毒载量。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清乙型肝炎病毒大蛋白(the hepatitis B virus large surface protein,HBV LHBs)水平。采用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测细胞中LHBs蛋白含量。结果 Benzyl-α-GalNAc能显著促进细胞凋亡,上清中HBV DNA和LHBs水平呈剂量依赖性增加;Benzyl-α-GalNAc抑制细胞中LHBs蛋白表达。结论抑制细胞O-糖基化修饰促进细胞凋亡,从而释放HBV LHBs和病毒颗粒;但在某种程度上抑制细胞O-糖基化修饰能够抑制细胞内LHBs合成。

O-糖基转移酶、Glt25D2与乙型肝炎包膜蛋白大蛋白的分泌有关

目的在前期研究结果提示Glt25D2与HBV包膜蛋白大蛋白(LHBs)在体外相互作用基础上证明Glt25D2是否与HBV LHBs分泌相关。方法采用激光共聚焦方法分析Glt25D2与LHBs在HepG2细胞内的定位。免疫共沉淀方法进一步证实Glt25D2与LHBs的相互作用。采用实时荧光定量PCR和Western blot方法分析mRNA和蛋白表达水平。应用ELISA方法检测细胞上清LHBs水平。实时荧光定量PCR方法检测上清HBV病毒载量。ELISA方法检测上清HBV LHBs水平。Western blot方法检测细胞中LHBs蛋白含量。Cobas Amplicor HBV Monitor Test方法检测细胞上清液HBV DNA载量。结果 Glt25D2与LHBs在体外相互作用,上调的Glt25D2高表达促进HBV DNA复制和LHBs表达,Glt25D2低表达抑制HBV DNA复制和LHBs表达。结论 Glt25D2与乙型肝炎包膜蛋白大蛋白的分泌有关。