鸡肠炎沙门菌毒力蛋白SipD生物信息学分析及原核表达

【目的】预测肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)SipD蛋白的潜在生物学功能,并表达纯化该蛋白,为探索SipD蛋白作为抗沙门菌纳米抗体的候选抗原提供理论依据。【方法】利用DNAStar软件对GenBank中公布的不同血清型沙门菌株SipD蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并通过在线软件对SipD蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中SipD基因序列设计引物,以鸡肠炎沙门菌标准菌株(ATCC 13076)为模板,PCR扩增SipD基因,构建pET-32a(+)-SipD重组质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。应用IPTG诱导重组SipD蛋白的表达,并利用Ni^(2+)亲和层析法纯化。应用SDS-PAGE和Western blotting检测SipD蛋白的表达情况。【结果】SipD蛋白在不同血清型沙门菌之间高度保守;SipD蛋白分子式为C_(1619)H_(2573)N_(441)O_(540)S_(8),无跨膜区,为膜外蛋白,不存在信号肽,该蛋白的第1~343位氨基酸具有来自超家族侵袭质粒抗原IpaD的保守结构域;SipD蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲占比分别为59.18%、6.41%、3.21%和31.20%;SipD蛋白与B细胞结合的抗原表位有12个。SipD基因长1 029 bp,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白的形式表达;经纯化、透析、浓缩后蛋白浓度为8.6 mg/mL。SDS-PAGE和Western blotting分析发现,SipD蛋白纯度较高,可用于免疫羊驼制备纳米抗体。【结论】SipD蛋白为膜外蛋白,具有较多抗原结合位点;经表达纯化得到纯度较高的SipD重组蛋白,为进一步制备靶向鸡肠炎沙门菌SipD蛋白的纳米抗体提供材料。

二氢杨梅素对雏鸡免疫功能的影响

【目的】探究二氢杨梅素(DHM)对雏鸡免疫器官指数、免疫器官组织学形态及血清中免疫因子含量的影响。【方法】选取150只7日龄海兰白蛋雏鸡,雌雄各半,随机分为5组,每组30只,对照组给予基础饲粮,给药组分别在基础饲粮中添加0.025%、0.05%、0.1%、0.2%DHM。试验于给药7、14、21、28及35 d时,每组随机选取6只雏鸡心脏采血,收集免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)分别称重,计算不同给药组雏鸡免疫器官指数,检测血清免疫球蛋白G(IgG)、补体(C3、C4)含量,并对给药35 d时雏鸡免疫器官进行HE染色观察组织形态。【结果】与对照组相比,0.2%DHM组在给药35 d时雏鸡胸腺指数显著升高(P<0.05),0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡脾脏指数均显著升高(P<0.05),0.1%、0.2%DHM组雏鸡法氏囊指数在给药7 d时显著增高(P<0.05)。饲粮中添加DHM后雏鸡免疫器官细胞排列整齐、淋巴细胞数量增多、结构更加致密。与对照组相比,0.05%、0.1%、0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡血清IgG含量均显著增加(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清IgG含量在给药21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.1%、0.2%DHM组雏鸡血清中补体C3含量在不同给药时间均显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C3含量在给药14和28 d时显著高于其他组,在21和35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.05%、0.1%和1.2%DHM组在14、28和35 d时雏鸡血清补体C4含量显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C4含量在给药14、21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%DHM组(P<0.05)。【结论】饲粮中添加0.2%DHM能促进雏鸡免疫器官生长发育,并且能提高雏鸡免疫因子的表达,增强雏鸡免疫功能。

二氢杨梅素对蛋雏鸡生长性能的影响

为研究二氢杨梅素(DHM)对蛋雏鸡生长性能的影响,选用7日龄海兰白蛋雏鸡150只随机分成5个组,每组30只。对照组给予基础日粮,给药组分别在基础日粮添加0.25、0.5、1、2 g/kg的DHM,试验期为35 d。结果显示,与对照组相比,42日龄时1 g/kg和2 g/kg的DHM组雏鸡平均体重显著增加(P<0.05);28和35日龄时0.5、1、2 g/kg DHM组平均日采食量显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01);35和42日龄时0.5、1、2 g/kg DHM组平均日增重显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),肉料比显著增加(P<0.05);此外,DHM对雏鸡心脏指数、肝脏指数、肾脏指数和存活率均无明显影响。由此可见,DHM能够促进蛋雏鸡生长发育并对心脏、肝脏和肾脏无不良作用,可作为养禽业中一种绿色安全的饲料添加剂。

丁香叶黄酮对小鼠药物性肝损伤的保护作用研究

为确定丁香叶黄酮的保肝作用,将小鼠随机分为5组,即对照组、模型组、丁香叶黄酮高剂量组(40 mg/kg体重)、中剂量组(35 mg/kg体重)、低剂量组(30 mg/kg体重),以血清转氨酶(ALT、AST)、肝组织指标(MDA、NO、SOD、GSH、GSH-Px)及II相药物代谢酶GSTA1为检测对象,结合小鼠肝脏病理变化综合分析。结果显示,丁香叶黄酮高剂量组血清转氨酶和肝组织中MDA、NO均极显著降低(P<0.01),SOD、GSH、GSH-Px均极显著升高(P<0.01),GSTA1的含量也极显著升高(P<0.01);肝脏组织病理学显示脂肪变性、坏死及炎性细胞浸润减轻;而中、低剂量组的各指标和组织学变化均不如高剂量组明显。研究表明,丁香叶黄酮以40 mg/kg体重剂量对小鼠药物性肝损伤有较好的保护作用。

急性酒精性肝损伤小鼠模型及早期诊断指标GSTA1的研究

为研究谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1)在肝损伤早期诊断中的价值,本试验通过检测血清谷丙转氨酶(GPT)及肝组织指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)变化,成功复制急性酒精性肝损伤小鼠模型;通过时间-效应和剂量-效应关系研究血清中GSTA1和ALT变化。结果显示,给予小鼠灌服乙醇溶液后,2 h血清中GSTA1含量变化与对照组相比差异极显著(P<0.01),而ALT活性变化在6 h才显示出一定的差异性(P<0.05);当乙醇剂量为10 m L/kg体重时,血清中GSTA1含量变化与对照组相比差异极显著(P<0.01),而当乙醇剂量达到14 m L/kg体重时,ALT活性变化与对照组相比差异极显著(P<0.01)。表明在急性酒精性肝损伤模型中,GSTA1的含量变化在肝损伤早期就可检测出来,作为肝损伤标记物,GSTA1比ALT更敏感。

黄连提取物和环丙沙星联用对鸡源沙门菌体外抑制作用的研究

为确定中药与环丙沙星联用对鸡源性沙门菌的抑菌作用,采用微量稀释法测定黄连、黄芩、五倍子、丁香醇提取物的最低抑菌浓度(MIC),筛选出抑菌作用较强的中药提取物,并用微量棋盘稀释法测定其与环丙沙星联用对沙门菌的部分抑菌浓度(FIC)。结果显示,4味中药醇提物对沙门菌都有一定的抑菌作用,黄连相对于其他3味中药具有较好的抑菌效果,对黄连醇提物按照黄连素提取工艺进一步提取,获得粗品,此次提取物提取率为8.17%。联合药敏试验结果显示,黄连提取物在1.28μg/mL时,使环丙沙星的MIC值降低至0.64μg/mL;而环丙沙星在1 562μg/mL时,黄连提取物的MIC值降低至781μg/mL,说明两药联合应用可明显增强环丙沙星或黄连的抑菌效果,而根据FIC指数判断标准可得FIC指数为0.75,这表明黄连提取物与环丙沙星体外联合抑菌作用表现为相加作用。

小鼠急性肝损伤中谷胱甘肽S转移酶A1的表达分析

为研究谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1)在3种急性肝损伤动物模型中的表达情况,选用雄性昆明系小鼠32只,随机分为4组,包括CCl_4组、APAP组、酒精组和对照组,按本课题组前期建立的方法复制三种急性肝损伤模型。采集血清检测转氨酶(ALT、AST),肝脏检测肝组织指标(SOD、MDA、GSH、GSH-Px),应用RT-PCR方法测定肝组织中GSTA1 mRNA表达量。结果显示,3种模型组中血清转氨酶及肝组织指标与对照组相比差异极显著(P<0.01);3种模型组中GSTA1 mRNA的表达量与对照组相比极显著降低(P<0.01),其中CCl_4组降低了4.9倍、APAP组降低了2.1倍、酒精组降低了3.7倍。研究表明,在急性肝损伤中,GSTA1 mRNA的表达水平与肝损伤的程度呈负相关。

银杏内酯C对2种骨关节炎模型中软骨病理变化、基质降解和炎症反应的影响

基于大鼠关节疼痛、软骨病理程度、ECM降解过程和炎症介质生成水平,探究银杏内酯C(GC)对2种造模方式的软骨保护效果。选取25只Sprague-Dawley大鼠随机分为5组:对照组(Control组)、模型1组(ACLT组)、给药1组(ACLT+GC组)、模型2组(MIA组)和给药2组(MIA+GC组)。试验4周后,收集大鼠右后肢股骨、胫骨和血液样本,应用番红O固绿染色和OARSI评分对大鼠股骨和胫骨病理程度进行评估;免疫组化检测软骨中CollagenⅡ和MMP-13的表达水平;ELISA检测大鼠血清中MMP-3、MMP-13、CTX-Ⅱ、COMP、COX-2、INOS、IL-1β和TNF-α的水平变化;冷敏感性试验和伸膝发声试验检测大鼠关节疼痛程度。结果显示,与MIA组相比,ACLT可造成更严重关节软骨结构损伤。ACLT组中股骨和胫骨的OARSI评分、MMP-13的表达和血清中MMP-13、MMP-3、CTX-Ⅱ、COMP水平均高于MIA组;然而ACLT组中炎症介质COX-2、IL-1β和TNF-α水平显著低于MIA组(P<0.01)。GC干预后可降低OARSI评分(P<0.05或P<0.01)和疼痛评分,抑制ECM基质降解酶(MMP-13、MMP-3)、软骨代谢标志物(CTX-Ⅱ、COMP)和炎症介质(COX-2、INOS、IL-1β和TNF-α)的表达,并促进CollagenⅡ的合成。结果表明,2种造模方式均可造成软骨损伤,其中ACLT+PMMx法构建OA模型中大鼠关节损伤明显,有利于研究软骨结构损伤程度。GC干预后可减轻2组大鼠OA模型中关节疼痛、软骨病理变化、基质降解程度和炎症反应,从而发挥保护软骨作用。