瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白的亚细胞定位及致病作用浅析

瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是近些年来出现的一种烟粉虱Bemisia tabaci传播的植物病毒,在瓜类生产中造成了严重损失。为了解该病毒外壳蛋白(coat protein,CP)在病毒侵染寄主过程中的亚细胞定位和致病作用,本研究以CCYV山东黄瓜分离物为研究对象,构建了荧光表达载体CP-YFP和异源表达载体pGR-CP。浸润荧光表达载体48 h后的本氏烟Nicotiana benthamiana叶片在激光共聚焦显微镜下可以观察到荧光信号在细胞质和细胞核内均有分布;浸润异源表达载体的本氏烟植株7 d后上部叶片开始显现花叶症状,13 d后顶部新叶出现严重皱缩和坏死斑点。以上结果表明CCYV CP蛋白参与了病毒对寄主的侵染过程,可能是症状形成的致病相关因子。本研究为进一步解析该病毒的致病机理提供了初步的理论支持。

北京地区枸杞白粉病病原菌的鉴定

为鉴定北京地区枸杞(Lycium chinense Mill)白粉病的病原,采用形态学对其病原菌有性世代闭囊壳形态进行显微观察,同时利用分子生物学方法克隆其rDNA ITS序列,在此基础上构建进化树,并分析其亲缘关系。结果表明,该白粉菌闭囊壳直径110.5~168.4μm,附属丝较多并生于闭囊壳的“赤道”部位,长度为60.4~220.4μm,其顶端1~3次二叉或三叉状分支;BLASTn显示其ITS序列(MG757562.1)与GenBank中的穆氏节丝壳(Arthrocladiella mougeotii(Lév.)Vassilk)的ITS序列同源性大于99.8%,而与其他白粉菌ITS序列的同源性小于91.0%;进化分析显示其与穆氏节丝壳中国菌株(JX546296.1、KP420475.1)、日本菌株(AB022380.1)、韩国菌株(AF455748.1)、土耳其菌株(KX017568.1)、澳大利亚菌株(AF073358.1)聚为一支,亲缘关系最近。因此,引起北京地区枸杞白粉病的病原菌鉴定为节丝壳属(Arthrocladiella)的穆氏节丝壳(A.mougeotii)。

山东寿光黄瓜上瓜类褪绿黄化病毒的分子鉴定

2016年,本研究在对山东黄瓜病毒病调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间病样进行了采集,提取总RNA后利用瓜类病毒引物进行RT-PCR检测,结果发现在利用瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)引物检测样品时,田间采集的25份疑似病样中13份能扩增到400 bp左右的目的条带。为进一步确认,我们又针对CCYV的外壳蛋白基因(CP)设计了特异性引物,对13份阳性样品进行检测,结果均能扩增到目的片段,对获得的CP基因片段进行克隆并测定序列,序列分析结果显示其CP基因序列全长753bp,编码1个由250个氨基酸组成的分子量28700的蛋白质。进一步序列分析结果显示其与CCYV已报道分离物有很高的同源性,并聚类到同一个大的分支,其中与日本分离物、希腊分离物及中国其他地区分离物相对近缘,聚类到一支,而与伊朗分离物近缘关系相对较远。这些结果说明山东黄瓜黄化病样上检测到的病毒为瓜类褪绿黄化病毒,这也是该病毒在山东侵染黄瓜的首次报道。

江苏省蚕豆上菜豆黄花叶病毒的分子鉴定

为掌握江苏省豆类作物上的病毒病种类,本研究于2018年对江苏省蚕豆作物病毒进行了调查,累计采集田间疑似病样55份,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间采集的疑似病样提取总RNA后进行了分子检测,结果发现,在用菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)检测引物进行RT?PCR扩增时有16份样品扩增到1条525 bp左右的条带,与目的片段大小一致,说明其中可能伴随有菜豆黄花叶病毒的感染。为进一步确定这一结果,我们针对BYMV CP基因设计了引物,以阳性样品RNA为模板进行RT?PCR,结果发现均扩增到预期大小的目的条带,对该片段回收、克隆并测定碱基序列,结果发现其CP基因碱基序列全长819 bp,编码1个由273个氨基酸组成大小约20 800的蛋白质。BLAST分析结果显示其与BYMV同源性最高(AB439731,99%),表明其属于BYMV的一个分离物。利用MEGA软件对其进行系统进化分析,结果发现这些分离物与日本的蚕豆分离物(AB439731)同源性最高,其次是澳大利亚的蚕豆分离物(HG970867)和中国青海的菜豆分离物(9?16)。这些结果表明江苏蚕豆上检测到的病毒是菜豆黄花叶病毒的一个分离物,这是该病毒在江苏侵染蚕豆的首次分子鉴定报道。

河南大蒜韭葱黄条病毒的分子鉴定及其系统进化分析

2019年本研究对河南大蒜病害进行调查时发现当地大蒜病毒病发生比较普遍,为明确病原种类,我们对田间样品进行采集(累计采集疑似病样38份)并利用葱蒜类病毒引物对其进行了RT-PCR检测。结果发现,在用韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)引物检测时,有33份样品中检测到1条大小为304 bp的目的条带,为了进一步确定检测到的病毒为LYSV,本研究对其外壳蛋白基因(CP)序列进行了克隆,结果发现其序列全长864 bp,编码1个由289个氨基酸组成的相对分子质量约32300的蛋白质。CP基因序列构建的系统进化树结果分析显示,其与LYSV其他分离物共同聚类到1个大分支,表明该病毒属于LYSV的1个分离物;同时序列分析结果也显示LYSV分为2支,本研究检测到的LYSV河南分离物与中国其他分离物共同聚类到1个分支,其中与中国厦门等地分离物同源性最高,而与之前检测到的河南分离物同源性相对较低。这些结果表明本研究在河南大蒜中检测到的病毒是韭葱黄条病毒,虽然之前在河南也有该病毒侵染大蒜的报道,但本研究检测到的分离物与之前报道的分离物之间差异比较大,暗示河南大蒜上可能出现了新的LYSV类型或株系,生产上应当重视。

瓜类褪绿黄化病毒编码的P6蛋白亚细胞定位及致病特征分析

以瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)山东寿光分离物作为研究对象,对其RNA1编码的P6蛋白进行克隆,发现其基因全长为159 bp,编码1个大约6 kD的蛋白,并含1个跨膜区。进一步构建了带有YFP标签的荧光表达载体P6-YFP,浸润本氏烟叶片后利用激光共聚焦显微镜观察,发现P6-YFP在细胞质和细胞核均有分布。将P6构建到马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)异源表达载体获得的PVX-P6接种本氏烟,发现接种PVX-P6的植株新叶伴有明显黄化、皱缩等症状,并沿叶脉出现坏死,而接种PVX空载体的植株仅有轻微的花叶,表明在PVX异源表达系统中,P6诱导寄主植物出现更严重的症状,暗示P6能增强PVX的致病性,可能是参与症状形成的致病相关因子。

蚕豆中三叶草黄脉病毒编码的NIa-Pro蛋白亚细胞定位特征初步研究

三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus,ClYVV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的重要成员。核内涵体a蛋白酶(NuclearInclusionaProtease,NIa-Pro)是一种由Potyvirus病毒编码的具有蛋白水解酶活性的蛋白,在病毒与寄主互作过程中参与多聚蛋白切割等多种功能的行使。选择2018年在江苏发现的ClYVV蚕豆分离物作为研究对象,对其NIa-Pro蛋白基因进行了克隆和序列测定,结果显示其全长729bp,编码1个24.3kD的蛋白。为进一步研究其亚细胞定位特征,构建了融合YFP荧光标签的重组表达载体YFP-NIa-Pro,利用农杆菌浸润法接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)。激光共聚焦显微镜观察结果显示,浸润处理后本氏烟叶片表皮细胞的细胞质及细胞核都有较强的荧光信号。取浸润区样品通过Western-blot检测,结果显示YFP-NIa-Pro在本氏烟叶片中正常表达。这些结果初步表明ClYVV编码的NIa-Pro在细胞质和细胞核均有分布。