野生动物结核病检测技术研究进展

结核病(Tuberculosis,TB)是一种人兽共患的慢性消耗性传染病,该病感染宿主广泛,可以交互传染,很难根绝。近年来野外和圈养野生动物的结核病疫情呈现增高的趋势,不但造成重大经济损失,而且影响到公共卫生安全。野生动物的结核病主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)所引发,其感染宿主谱很广,并具有或潜在具有传播给人类的能力。因此,建立快速准确的结核病检测方法意义重大。现在较为广泛使用的结核病检测方法主要分为3大类,分别是细菌学检测、免疫学检测以及分子生物学诊断,但是这些检测方法仍存在许多问题。目前对于野生动物结核病检测迫切需要新的快速、灵敏、特异的动物结核病诊断方法。本文就现行的检测技术研究进展作一简要概括。

牛分枝杆菌PtpA蛋白对NF-κB信号通路的调控机制

[目的]研究牛分枝杆菌Mycobacterium bovis PtpA蛋白对免疫应答相关的NF-κB信号通路的影响,以揭示PtpA蛋白在机体免疫应答中的作用。[方法]构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA,并将其转染到HEK293T中,进行SDS-PAGE分析及Western blot检测。激活NF-κB信号通路后,通过双荧光素酶试验和qPCR方法探究PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响。[结果]成功构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA,转染HEK293T后经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为22 000处可见特异性蛋白条带。Western blot结果显示,表达产物可与一抗特异性结合,证明该蛋白是PtpA蛋白。双荧光素酶试验中,转染2~24 h,试验组与对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光强度的比值差异显著(P<0.05);转染2 h后,对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光值是试验组的2.93倍,说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活早期具有显著的抑制作用。qPCR结果显示,转染2 h后,对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的3.93、3.42、2.17和2.30倍(P<0.01);转染4 h后,对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的4.26、3.93、2.36和2.50倍(P<0.01),说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路相关的细胞因子(IL-6、GM-CSF、BIRC-2、BIRC-3)在免疫早期具有显著抑制作用。[结论]qPCR结果与双荧光素酶试验结果一致,表明牛分枝杆菌PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响主要发生在早期。本研究为后续研究有效的结核病防控药物提供了理论基础。

广东省部分地区奶牛乳房炎凝固酶阴性葡萄球菌的毒力基因和耐药性分析

为了解广东省部分地区奶牛乳房炎凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative Staphylococci,CNS)的毒力基因的分布情况和耐药现状,进而为奶牛乳房炎的防治提供依据。本试验对广东省部分地区奶牛场110份乳房炎奶样中分离出的40株CNS采用PCR方法检测毒力基因、耐药基因和耐消毒剂基因,K-B试纸片法检测药敏性。结果表明CNS毒力基因检测中检测率最高的为fnbp(17.5%),其次为seb(15%)和tsst(15%),毒力基因型复杂(15种)。耐药性检测中对链霉素、红霉素和青霉素G耐药率较高,对苯唑西林、头孢曲松和头孢唑啉较敏感,多重耐药率高(52.5%)。耐药基因检测率最高的为喹诺酮类基因qnrA/B/C/D(20%),耐药基因链霉素耐药表型主要由aac6-aph2介导,耐消毒剂基因检测率最高的为qacG(25%),耐药基因和耐消毒剂基因的基因组型复杂(14种)。

牛分枝杆菌PtpA基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为深入研究牛分枝杆菌PtpA基因在细胞免疫过程中所发挥的具体调控作用。本研究以牛分枝杆菌基因组为模板扩增得到PtpA基因，通过分子克隆的方法构建完成PtpA基因原核表达载体．并将表达载体质粒转入感受态细菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达后进行SDS—PAGE分析，在约35ku处可见特异性蛋白条带。以抗组氨酸标签（HIS）单抗为一抗，对表达产物进行Western—blot检测，结果显示，表达产物可与抗HIS标签单克隆抗体发生特异性结合，证明该蛋白为所需的PtpA蛋白。通过免疫新西兰大白兔获得抗PtpA血清，所得血清用间接ELISA方法测得的血清抗体效价超过1：1000000．具有较好的灵敏性。采用制备的PtpA多克隆抗体检测表达纯化的PtpA融合蛋白及真核表达的PtpA蛋白．结果可在约35ku和约20ku处产生特异性条带，表明该抗体有较强的特异性。本研究为后续PtpA基因调控细胞免疫的具体机制的研究奠定了基础。