李小食心虫GfunOBP2的原核表达及气味配体结合特性

【目的】通过测定李小食心虫(Grapholita funebrana)Plus-C气味结合蛋白2(odorant binding protein,GfunOBP2)结合性信息素和苹果树挥发化合物的能力,分析GfunOBP2的嗅觉功能,为阐释李小食心虫定位寄主植物的嗅觉分子机理打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增GfunOBP2的ORF序列,通过同源注释和比对氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)的分布模式确定GfunOBP2属于Plus-C OBP亚家族;利用RT-qPCR检测GfunOBP2在李小食心虫3日龄成虫触角、头、胸、足、翅、腹部和性腺中的相对表达量;构建pET30a(+)/GfunOBP2原核表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞中表达GfunOBP2重组蛋白。利用荧光竞争结合试验测定重组GfunOBP2蛋白对5种性信息素和35种苹果树挥发化合物的结合能力;通过分子对接预测GfunOBP2与具有强结合能力的气味配体的相互作用力及关键氨基酸残基。【结果】克隆获得GfunOBP2(GenBank登录号:OQ054799.1)的全长序列,共编码183个氨基酸,氨基酸序列中有12个保守的Cys,其分布模式表明GfunOBP2属于Plus-C OBP。GfunOBP2主要在成虫触角中表达,在雄虫触角中的相对表达量显著高于雌虫触角(P<0.05)。重组GfunOBP2蛋白对反-2-己烯-1-醇、苯甲醇、1-庚醇、1-癸醇、己醛、庚醛、乙酸-顺-3-己烯酯、2-甲基丁酸叶醇酯、α-罗勒烯、β-石竹烯、α-蒎烯和柠檬烯具有强结合能力,抑制常数Ki均小于5.0μmol·L^(-1)。分子对接结果显示氢键、Donor-Donor相互作用和烷基相互作用是GfunOBP2结合反-2-己烯-1-醇、1-庚醇和1-癸醇的主要弱相互作用力,氢键和碳氢键是GfunOBP2结合乙酸-顺-3-己烯酯和2-甲基丁酸叶醇酯的主要弱相互作用力,烷基相互作用是GfunOBP2结合α-罗勒烯和β-石竹烯的唯一弱作用力。疏水性氨基酸Ile、Pro、Phe、Ala、Leu和Val在GfunOBP2结合气味配体中起着重要作用。【结论】GfunOBP2主要在李小食心虫成虫触角中表达,重组GfunOBP2蛋白对被测的35种苹果树挥发化合物中的12种具有强结合能力、对10种化合物具有中等结合能力,表明其在识别寄主植物挥发化合物的过程中起着重要作用。研究结果为证实Plus-C OBP参与李小食心虫外周嗅觉通讯提供了理论依据。