ARDRA方法在荧光假单胞菌分离鉴定中的应用

【目的】探索荧光假单胞菌的分类方法,分离筛选拮抗性较强的荧光假单胞菌。【方法】利用紫外下产生荧光的特性,采用梯度稀释及鞭毛染色的方法,对采自云南、海南、山东和新疆的488份植物根际土壤进行分离筛选,分离菌株进行ARDRA分析,采用室内平板对峙法筛选对植物病原真菌具有较强拮抗作用的菌株,并对其进行生理生化分析和分子鉴定。【结果】分离筛选到102株紫外下产生荧光的杆状单极生鞭毛菌株。ARDRA分析产生荧光假单胞菌类型、恶臭假单胞菌类型以及一个未知的谱带类型。以油菜立枯病菌作为靶标菌,筛选到25株具有拮抗作用的菌株,其中TC222产生的抑菌圈最大,进一步的生测结果表明该菌株对9种重要的植物病原真菌如番茄灰霉病菌等具有很强的拮抗活性。TC222的16SrDNA核苷酸序列与荧光假单胞菌PfO-1同源性达到99%,其最终鉴定为荧光假单胞菌。【结论】ARDRA方法在分子水平上为荧光假单胞菌的分离鉴定探索了一条新途径;TC222菌株具有拮抗多种植物病原真菌的能力,显示了良好的应用前景。

胸腺肽基因转化生菜及其表达的研究

以4d苗龄的美国大速生生菜无菌苗子叶为外植体,通过根癌农杆菌介导, 将胸腺肽基因(thy)导入生菜。研究结果表明,含有卡那霉素75 mg·L-1的MS1-1培养基(MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1NAA+Cb500 mg·L-1) 为最适子叶外植体转化后诱导芽再生的培养基,经抗性筛选,将抗性芽切下于MS1-2培养基(1/2MS + Kan50mg·L-1+Cb100 mg·L-1)上诱导生根。通过PCR和Southern杂交分析证明,胸腺肽基因已经整合到生菜基因组中。RT-PCR检测初步表明, 胸腺肽基因可以在生菜中正常转录。

外源基因在植物病毒表达载体中表达策略的研究进展

利用植物病毒表达载体表达外源蛋白是近年来发展起来的具有表达量大、速度快和廉价等优势的生产系统 ,其有 4种构建策略 :基因取代、基因插入、融合抗原和基因互补。此外还从病毒表达载体的基础性研究和商业应用方面进行了详细讨论。

高等植物中一碳化合物代谢研究进展

高等植物中一碳(C1)化合物的代谢主要包括甲醇代谢、甲醛代谢和甲酸代谢等,它们是高等植物一碳单位代谢的重要组成部分.由于C1化合物的代谢机制复杂、代谢规模非常小、参与代谢反应的酶和中间产物的含量低且不稳定等特点,相关研究报道很有限.现代生化和分子遗传学方法的综合使用使得人们对参与植物中C1化合物代谢的酶和基因有了一定程度的了解,该文主要综述了近年来有关高等植物中内源和外源C1化合物甲醇、甲醛和甲酸的来源和代谢途径方面的研究进展,并提出了该研究领域目前存在的问题和今后的研究方向.

外源IAA增强丹波黑大豆抗铝性的生理机制

以铝耐受型丹波黑大豆(RB)幼苗为供试材料,考察了不同浓度铝胁迫下添加外源IAA对RB根尖内源IAA、H2O2、MDA、铝含量、柠檬酸分泌量以及质膜H+-ATPase活性的影响,探讨外源IAA增强RB抗铝能力的生理机制。结果显示:(1)经25、50和200μmol·L-1 AlCl3胁迫处理24h后,RB根尖IAA含量、柠檬酸分泌量和质膜H+-ATPase活性均表现为先上升后下降的趋势,而H2O2、MDA和根尖铝含量却随着铝处理浓度的增加呈显著上升趋势。(2)与单独25、50和200μmol·L-1 AlCl3胁迫处理相比,添加50μmol·L-1外源IAA后使得RB根尖铝、MDA和H2O2含量均显著降低,同时使RB根尖柠檬酸分泌量分别相应增加到单独处理的2.39、1.73和6.85倍,且其相应的质膜H+-ATPase活性也增加了1.09、1.74和1.45倍。研究表明,外源IAA能通过增强丹波黑大豆根尖柠檬酸的分泌量和质膜H+-ATPase活性来提高其对铝胁迫的抗性,明显缓解铝毒害作用。

△12-脂肪酸去饱和酶FAD2的基本特性及其在胁迫中的功能

脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)催化与载体结合的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸在脂酰链上形成双键.脂肪酸去饱和酶可以分为脂酰ACP去饱和酶、脂酰CoA去饱和酶和脂酰脂去饱和酶三类.而脂酰脂去饱和酶中的△12-脂肪酸去饱和酶(△12 fatty acid desaturase,FAD2)是催化脂肪酸链第12位碳原子形成双键的去饱和酶类,控制着油酸、亚油酸和其他多种不饱和脂肪酸的合成和含量.主要从△12-脂肪酸去饱和酶FAD2的基本特性和在胁迫中的功能进行了综述,并对相关研究领域的未来研究方向进行了展望.

观赏植物叶片对甲醛吸收能力的研究

用甲醛溶液处理5种观赏植物的叶片,测定不同植物叶片对甲醛的吸收能力,并研究环境温度、甲醛溶液的酸碱度和消毒处理对植物叶片吸收甲醛能力的影响。结果表明,5种观赏植物的叶片对甲醛均有一定的吸收能力,环境温度和甲醛溶液的酸碱度对植物叶片吸收甲醛的能力均有影响,且植物叶片上的微生物也可吸收甲醛。

含有Rubisco小亚基启动子和转运肽序列的通路克隆入门载体的构建和应用(英文)

Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR-2B的XmnⅠ位点改造成HindⅢ位点,产生入门载体pENTR*-2B,然后将番茄1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基3C的启动子(PrbcS)及其转运肽序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因亚克隆到pENTR*-2B中,构建通路克隆入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP.实验结果证实,用pENTR*-PrbcS-*T-GFP和通路克隆的植物表达载体进行LR反应,构建GFP的光诱导型植物表达载体,可以成功地将表达的GFP定位到转基因植物的叶绿体中.利用β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因替代该入门载体中的GFP基因做试验也得到相似的结果.这说明用目的基因替换该入门载体中的GFP可以构建目的基因的入门载体,然后用通路克隆技术可以快速构建其光诱导型植物表达载体,将表达的目的蛋白定位到转基因植物或组织细胞的叶绿体中.

通路克隆入门载体pEN-L4＊-PrbcS-＊T-gfp-L3＊的构建及其应用

为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台.

建设研究教学型学院背景下微生物学实验课程改革

微生物学实验课程是生物相关理学类、工程类课程的基础,在培养生命科学相关领域的科学研究和生物工程高素质人才培养中具有举足轻重的作用。昆明理工大学微生物学课程组近几年来围绕创新型人才培养,改变分散、低效的教学内容和教学模式,深度整合利用科研实验室资源,对微生物学实验课的教学进行一系列的改革与探索,是微生物学实验改革的有益实践。

来源于大肠杆菌的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶的原核表达与活性测定

同源性搜索显示大肠杆菌中存在核酮糖单磷酸途径关键酶6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)基因的同源序列,但没有其相关活性和功能方面的报道。本研究利用PCR方法从大肠杆菌的基因组中扩增hps和phi的同源序列(分别简称为Ehps和Ephi),构建了大肠杆菌Ehps和Ephi基因的原核表达载体pDEST17-Ehps和pDEST17-Ephi,表达和纯化了重组蛋白EHPS和EPHI,酶活性检测结果表明EHPS和EPHI具有活性。

三七根腐病病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性分析

目的:旨在分离鉴定三七苗期根腐病病原菌,并对其生物学特性进行研究,从而了解该病原菌的发病条件,为该病原菌引起的三七病害的监测和防治提供理论参考。方法:采集三七根腐病幼苗,用PDA培养基对病原菌进行分离纯化,得到了2株真菌。通过对菌落、菌丝和孢子形态观察及ITS序列的比对,对其中1株病原菌进行了鉴定。并研究了温度、pH、光照、碳源及氮源等对菌丝生长和孢子萌发的影响。结果:该病原菌鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。将病原菌回接一年生三七植株,发现其有很强的致病性。该病原菌在30℃、pH 5的培养条件下生长最快,可有效利用多种碳和氮源,其中以淀粉、乳糖为最佳碳源,硝酸铵为最适氮源。孢子在30℃、pH 6~7的条件下萌发率最高,孢子的致死温度为50℃。结论:明确了三七苗期根腐病病原菌(尖孢镰刀菌)的生物学特性,确定了该病原菌生长和孢子萌发的最适培养条件。

甲醛氧化途径关键酶重组蛋白的生化特性及固定化酶吸收甲醛效果研究

甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase,ADH)与甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)是甲醛氧化途径的两个关键酶.恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PADH是一种不依赖谷胱甘肽可以把游离甲醛直接氧化为甲酸的脱氢酶,博伊丁假丝酵母菌(Candida boidinii)的FDH在有NAD+存在时可以把甲酸氧化为二氧化碳.以基因组DNA为模板用PCR方法,从P.putida中扩增出PADH基因的编码区(padh),从C.boidinii中扩增出FDH的编码区(fdh),然后亚克隆到pET-28a(+)中分别构建这两个基因的原核表达载体pET-28a-padh和pET-28a-fdh,转化大肠杆菌,利用IPTG诱导重组蛋白PADH和FDH的表达.通过优化条件使重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的70%以上,通过亲和层析法纯化出可溶性PADH和FDH重组蛋白.对重组蛋白的生化特性分析结果表明:PADH在最适反应温度50℃的活性为1.95 U/mg;FDH在最适反应温度40℃的活性为0.376 U/mg.所表达的重组蛋白与之前报道过的相比,具有更好的热稳定性和更广的温度适应范围.将PADH、FDH两个重组蛋白及辅因子NAD+固定到聚丙烯酰胺载体基质上,对固定化酶甲醛吸收效果的初步分析结果显示固定化酶对空气中的甲醛有一定的吸收效果,说明这两种酶被固定后具有开发成治理甲醛污染环保产品的潜力.

微生物甲醛脱氢酶的研究进展

甲醛脱氢酶(FADH)属于中等锌链醇脱氢酶家族中的一员,存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中,是微生物中主要用于甲醛解毒的酶。近年来一些研究确定甲醛脱氢酶还具有S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)的活性,用于调节内源性NO的动态平衡。对微生物甲醛脱氢酶的结构,生理生化特性,基因克隆以及在环保上的应用方面进行综述。

多糖和激素对珠芽魔芋多叶形成的调控作用

【目的】探究多糖和激素对珠芽魔芋多叶形成的作用,为调控珠芽魔芋多叶萌发生长提供理论依据。【方法】2020年,分别采集自然生长珠芽魔芋1叶期至4叶期幼苗,以当年仅着生1片复叶的花魔芋为对照,测定各时期的叶柄长、球茎鲜质量和根长,以及各器官中还原性多糖、淀粉以及玉米素(ZT)、赤霉素(GA_(3))、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)含量变化;2021年,分别以20μg/L ZT溶液和40μg/L IAA溶液喷施珠芽魔芋幼苗,以喷施清水的珠芽魔芋幼苗为对照,分别采集幼苗1叶期至4叶期最新萌发嫩叶,测定各时期新叶中ZT、GA_(3)、IAA和ABA含量。【结果】(1)2020年,随着生长期延长,珠芽魔芋幼苗各生长时期的叶柄长、球茎鲜质量和根长均呈增加趋势,但是均低于花魔芋。各时期珠芽魔芋幼苗各器官中还原性多糖、淀粉含量均随着生长期的延长而增加;新叶中的还原性多糖和淀粉含量比老叶低。随着生长期的延长,珠芽魔芋幼苗叶片和根的ZT含量均明显增加,各时期新叶ZT含量比老叶低;而叶柄和球茎的ZT含量明显降低。随着生长期的延长,珠芽魔芋幼苗各器官中GA_(3)、IAA和ABA含量逐渐上升,新叶GA_(3)、IAA和ABA含量总体比老叶高。随着生长期的延长,各时期花魔芋不同器官糖和激素含量变化幅度较小,且均低于珠芽魔芋。(2)2021年,与对照相比,喷施ZT后,珠芽魔芋幼苗嫩叶ZT含量明显增加,且明显促进了幼苗侧叶形成速度;喷施IAA明显增加了幼苗IAA、GA_(3)和ABA含量,显著抑制了珠芽魔芋幼苗侧叶形成。【结论】珠芽魔芋中较高含量糖分和ZT及较低含量GA_(3)、IAA和ABA有利于珠芽魔芋侧叶萌发和生长。

微生物耐铝机制的研究进展

铝毒是酸性土壤中限制作物生产最主要的因素。微生物与铝作用逐渐受到关注,一些微生物特别是模式微生物的耐铝机制已被提出。主要综述了酵母,假单胞菌及其它微生物耐铝机制的研究进展,并展望了微生物耐铝机制研究发展的方向。

细菌中H_4MPT依赖甲醛氧化途径研究进展

四氢甲基蝶呤(H4MPT)依赖的甲醛氧化途径是甲基营养菌氧化甲醛的途径之一,是能量代谢途径的中心部分,也是细菌中广泛存在的甲醛脱毒途径。甲醛激活酶、NAD(P)依赖-亚甲基-H4MPT脱氢酶、甲川-H4MPT环化水解酶和甲酰转移酶/水解酶复合物是该途径的关键酶。该文综述了细菌中H4MPT依赖甲醛氧化途径的生理作用以及近年该途径中关键酶特性及其基因组织结构的研究进展,并分析存在问题、展望今后研究方向。

丙环唑对三七生理生化影响及膳食风险评估

为了研究丙环唑处理后三七各部位残留量与膳食风险,及其对三七的生理生化影响,该研究采用盆栽实验叶面喷施丙环唑的方式研究了其残留特征,对三七叶片损伤、渗透调节物质含量、抗氧化酶系统和非酶系统及主根中皂苷含量的影响。结果表明,在施用浓度相同的情况下,丙环唑在三七各部位的残留量随施药次数的增加而增加,随采收间隔期的延长而降低。按人参推荐剂量(132 g·hm^(-2))施药1次,其半衰期为11.37~13.67 d,在三七中施药1~2次后,丙环唑对食用人群膳食摄入风险较低。推荐浓度及以上的丙环唑处理可以造成三七叶片MDA含量和相对电导率的显著升高,活性氧物质的累积,促进渗透调节物质含量的显著升高。1/2人参推荐剂量(66 g·hm^(-2))丙环唑处理即可促进三七叶片中超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性的显著升高,推荐浓度以上丙环唑处理抑制谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性,从而降低还原型谷胱甘肽(GSH)含量。丙环唑处理可以改变三七主根5种主要皂苷的比例,1/2人参推荐剂量促进皂苷累积,推荐浓度以上丙环唑处理显著抑制皂苷的累积。综上所述,根据人参推荐剂量使用丙环唑防治三七病害,会对三七产生胁迫作用,1/2人参推荐剂量对三七不会造成胁迫,而且会促进皂苷的累积,但其对三七病害的防效仍需加强研究。

Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用

随着广宿主载体系统的发展,Tn5及其衍生载体已经广泛应用于革兰氏阴性细菌的分子遗传学研究。主要综述了Tn5转座突变技术在生防细菌生防机理研究、细菌必需基因的鉴定、病原细菌毒力相关基因研究、代谢调控基因研究和菌株的遗传改良方面的应用研究进展。

土壤有益细菌在植物根际竞争定殖的影响因素

在土壤有益微生物应用于生物肥料、生物杀虫剂、植物生长刺激剂和生物处理剂的过程中,根际定殖具有重要作用。细菌在植物根际定殖是一个比较复杂的过程,影响定殖能力的因素也是复杂多样的。本文综述了参与根部竞争定殖的生物因素,包括受细菌遗传控制的某些特性如鞭毛/运动性、趋化性、多糖、位点特异重组酶/菌落阶段变异、NADH脱氢酶,植物根的分泌物和植物种类等;影响微生物根际定殖的非生物因素如土壤类型、土壤特性和土壤温度等,探讨了影响微生物根际定殖的主要研究方向。