一株可诱导海带配子体产生白化病的细菌的分离与鉴定

海带(Saccharina japonica)是一种重要的经济养殖海藻。中国海带与褐藻胶的产量分别占世界总产量的60%和90%。与高等农作物相似,在海带育苗及养殖过程中常常会暴发病害,严重时可造成20%~50%的减产。分离、鉴定致病菌及其致病因子是预防和控制病害发生的前提条件。由于海藻的致病菌大多是条件致病菌,迄今为止,海带致病菌的分离和鉴定仍是一个瓶颈问题。本研究运用传统微生物分离培养方法从脱苗病海带幼苗藻体分离出一株致病菌LJ2-4,经过复染实验及科赫法则验证,证实该菌株在实验室条件下可使健康海带雌、雄配子体产生白化的病症。LJ2-4菌落圆形、边缘完整,呈浅橙色。扫描电镜和透射电镜观察表明:LJ2-4菌体呈球形/杆状,长0.5~1.2μm,宽0.4~0.7μm无鞭毛。经16S rDNA分子鉴定,其与Planococcus okeanokoites IFO 12536^(T)的相似性为99.45%。结合LJ 2-4的生理生化特性,将该菌株命名为Planomicrobium okeanokoites LJ2-4。P.okeanokoites LJ2-4是在实验室条件下可引起健康海带配子体产生白化病的条件致病菌。本研究为海带致病菌致病机理的研究奠定了前期工作基础,同时也可为预防与控制海带苗期脱苗病的暴发提供理论依据。

补充CO2对气升式光生物反应器中萱藻丝状体生长、生理及发育的影响

为实现萱藻丝状体的快速扩增,本实验以萱藻丝状体为研究对象,应用实验生态学方法对三种充气条件(充空气、连续充CO2以及基于培养液pH稳定在7.5~8.0条件的间歇充CO2)下气升式光生物反应器中萱藻丝状体的生长、生理及发育进行了比较研究。结果显示,间歇充CO2可显著提高萱藻丝状体的日均增长率,扩增18 d日均增长率为(24.15±2.34)%,显著高于充空气与连续充CO2组;间歇充CO2条件下萱藻丝状体代谢旺盛,生长良好,光合放氧及呼吸耗氧速率分别为(25.99±1.88)和(15.98±0.97)μmol O2·g^-1 FW·h^-1,较连续充CO2组分别提高了38.23%和55.05%,较充空气组分别提高了57.91%和43.46%;间歇充CO2可促进萱藻丝状体孢子囊的发育,诱导18 d孢子囊比例可达(51.03±0.78)%,显著高于充空气组与连续充CO2组;间歇充CO2条件下扩增获得的丝状体游孢子放散量及附着率最高,经阴干刺激,放散2 h后孢子放散量为(11.33±1.33)×104 ind/mg FW,48 h后附着率为(90.67±2.40)%,较连续充CO2组分别提高了17.24%和3.82%,较充空气组分别提高了99.82%和5.54%。

二氧化锗对共培养萱藻丝状体和硅藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体保存和扩增过程中出现的小伪菱形藻与碎片菱形藻的生长,本实验应用实验生态学方法,分别建立了丝状体与小伪菱形藻、丝状体与碎片菱形藻、丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系,研究了1.00～4.00μg/mL二氧化锗(GeO_2)对共培养条件下丝状体生长发育及附生硅藻生长的影响。结果显示:(1)处理萱藻丝状体和硅藻共培养体系的适宜GeO_2浓度为1.00～2.50μg/mL,各实验组14 d的硅藻抑制率均高于67.33%±5.18%,且丝状体生长发育良好,2.00μg/mL为最适浓度,此浓度下丝状体日均增长率最高,在各培养体系中均大于11.00%,且诱导后孢子囊枝比例和孢子囊直径分别为57.47%±5.31%和(24.55±1.01)μm,与对照组差异不显著;(2) 3.50和4.00μg/mL GeO_2虽对硅藻抑制效果更佳,但同时也会抑制丝状体生长和后期孢子囊的形成与发育,其中4.00μg/mL GeO_2可导致丝状体死亡;(3)碎片菱形藻较小伪菱形藻对GeO_2更敏感。实验14 d,各浓度GeO_2对碎片菱形藻的抑制率为(82.10%±2.40%)～(96.35%±0.79%),均高于同浓度GeO_2对小伪菱形藻的抑制率;同时在丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系中,碎片菱形藻占硅藻比例随GeO_2浓度升高而相应下降。

恩诺沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响

为有效抑制萱藻种质保存和丝状体扩增时膨胀色球藻的污染,本实验应用实验生态学法,研究了恩诺沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林3种抗菌药对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响。结果显示:在5~100 mg/L范围内,50 mg/L恩诺沙星适于除去萱藻种质保存或丝状体扩增过程中出现的膨胀色球藻,实验第18 d膨胀色球藻的日均增长率为-2.67%,萱藻丝状体的单室孢子囊发育良好;在10~150 mg/L范围内,100 mg/L磺胺嘧啶能有效抑制膨胀色球藻的生长,实验第18 d膨胀色球藻的日均增长率为-0.58%,萱藻丝状体日均增长率为2.91%,单室孢子囊发育良好;150 mg/L磺胺嘧啶会使萱藻丝状体的部分细胞呈浅褐色,单室孢子囊发育不良;在1~20 mg/L范围内,20 mg/L呋喃西林能抑制膨胀色球藻的生长,实验第18 d膨胀色球藻日均增长率为-0.78%,但同时影响了萱藻丝状体的正常生长,单室孢子囊发育不良。实验证明,50 mg/L恩诺沙星和100 mg/L磺胺嘧啶最适于解决萱藻种质保存和丝状体扩增过程中膨胀色球藻的污染。

萱藻(Scytosiphon lomentaria)无菌种质获取技术研究

本研究将抗生素处理法与固体平板培养法相结合,对获取无菌萱藻种质的技术进行探索研究。萱藻种质首先经过匀浆机处理(50Hz,59s)、无菌海水冲洗过滤,然后在黑暗条件下,以抗生素混合液(头孢噻肟钠800μg/L、红霉素200μg/L、亚胺培南200μg/L、乙酰磺胺1600μg/L和制霉菌素16μg/L)处理7d,之后转移至固体平板培养后光照条件下培养形成藻落。经过固体培养平板、液体培养基及DAPI染色三种方式确认20个样品中有19个达到了无菌状态,成功率达95%。结果表明这种获取无菌萱藻种质的方法是成熟可靠的。

温度对不同地理种群萱藻孢子附着、萌发及幼配子体早期发育的影响

为比较中国南北方不同地理种群萱藻繁殖生物学特性的差异,本研究应用实验生态学方法,以实验室保存的野生萱藻种质为材料,比较了温度对中国北方(大连)、南方(温州)不同地理种群萱藻孢子附着、萌发及幼配子体早期发育的影响。结果显示,大连萱藻孢子附着的适宜温度范围为14~18℃,最适温度为16℃,而温州萱藻孢子附着的适宜温度范围为16~20℃,最适温度为18℃;大连萱藻孢子萌发的适宜温度范围为10~18℃,14℃下孢子萌发率最高,实验第9天萌发率达到(19.62±0.78)%,温州萱藻孢子萌发的适宜温度范围为12~18℃,16℃下孢子萌发率最高,实验第9天萌发率达到(19.94±1.45)%;大连萱藻幼配子体生长的适宜温度范围为10~16℃,最适温度为12℃,该温度下培养30 d幼配子体长度为(0.50±0.03) mm,温州萱藻幼配子体生长的适宜温度范围为12~16℃,最适温度为14℃,该温度下培养30 d幼配子体长度为(0.41±0.01) mm。