脐带血造血干细胞体外生成红细胞过程中高效脱核体系的研究

目的 研究磷脂酰肌醇三羟激酶(PI3K)、组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)和细胞松弛素B对脐带血造血干细胞体外培养促红系脱核的作用,以期建立高效脱核体系。方法 采用磁分选富集脐带血CD34+细胞。在培养第0、4天添加干细胞因子(SCF)、IL-3、促红细胞生成素(EPO),培养第7天添加SCF、EPO,培养第11、15、18天仅添加EPO。分别于第7、11、15和18天添加PI3K(0、25、50、100 ng/mL)、HDAC2(0、60、150、300 ng/mL)、细胞松弛素B(0、25、50、75 ng/μL)3种脱核剂。采用正交设计实验分析3种脱核剂的浓度和添加时间4因素4水平对促红系脱核效果的影响,获得最佳脱核条件并作为优选组,以不加脱核剂培养作为对照组进行验证。细胞培养至第21天时,用流式细胞仪分别检测CD235+、SYTO-64-细胞,计算脱核率。使用血细胞计数仪检测RBC,ELISA法检测2,3-二磷酸甘油(2,3-DPG)、化学发光法检测ATP,观察细胞形态。结果 最佳脱核条件为培养第15天添加PI3K浓度为100 ng/mL、HDAC2浓度为150 ng/mL和松弛素B浓度为75 ng/μL。培养至第21天,优选组红细胞脱核率为(74.30±5.59)%,对照组为(28.30±14.10)%,优选组高于对照组(t=9.099,P=0.012)。培养体系获得RBC平均可达2×1010/L,红细胞ATP、2,3-DPG与正常红细胞无差异,红细胞形态与正常红细胞一致。结论 以上最佳脱核条件建立的培养体系可促进造血干细胞体外生成红细胞高效脱核。

不同铝浓度处理对大豆种子萌发的影响

以大豆品种浙春3号和华春18为材料,设置不同铝浓度处理,研究了铝对这2个大豆品种种子萌发的影响。结果表明,低浓度的铝降低了种子质膜透性,提高了种子的发芽率、发芽势和发芽指数,对种子的发芽有一定的促进作用,而高浓度的铝则对萌发有一定的抑制作用。同时,2个大豆品种对铝的敏感度以及耐铝性都不同。

MICB基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的将中国汉族人群中不同分布频率的MICB基因克隆到原核表达系统,表达MICB蛋白并对蛋白进行鉴定和纯化,为体外建立MICB抗体检测方法和研究MICB等位基因功能奠定基础。方法收集外周血标本测序分析MICB基因2～4号外显子,获取不同分布频率的基因型,分别将分布频率】50%的MICB*005等位基因,分布频率为10%左右的MICB*00201、MICB*00401的等位基因,和分布频率【1%的MICB*018等位基因的外周血标本提取总RNA,经RT-PCR获取此4个等位基因的cDNA。扩增此4个MICBcDNA2～4号外显子,将目的片段连接至TOPO克隆载体,提取质粒测序分析,

MICB基因2～6外显子测序方法的建立及其应用

目的MHCⅠ类链相关基因B（MICB）是非经典的HLAⅠ类分子,可与NKG2D相互作用调节NK细胞的活性。本研究旨在建立MICB基因2～6外显子的聚合酶链反应-序列测序方法（PCR-SBT）,并分析汉族人群MICB在高分辨基因分型水平上的分布特征。方法根据GenBank数据库MICB基因有关序列（ID NC000006.11）,采用Primer3input计算机软件辅助设计引物,利用聚合酶链反应扩增MICB基因2～6外显子序列片段,扩增片段采用双酶切纯化后,按BigDye terminator v3.1sequencing Kit试剂盒操作进行测序反应,利用Assign3.5SBT分析软件指定等位基因型。

ABO血型新等位基因Ael08的分子生物学研究

目的研究ABO新等位基因Ael08的分子机制。方法利用单克隆抗体检测先证者标本红细胞ABO血型抗原，标准A、B、O红细胞检测血清中的ABO抗体，吸收放散试验检测红细胞上微量抗原；采用PCR技术扩增先证者ABO基因的第5～7外显子序列，PCR产物经双酶切后直接测序分析6和7外显子；扩增产物经TOPOTA克隆到质粒载体中获得单链，对所得克隆作ABO基因第6、7外显子双向测序分析；家系调查采集先证者父亲和哥哥的标本作血型血清学试验和ABO基因第6和7外显子直接测序分析。结果先证者红细胞上表达很弱的A抗原，只有通过吸收放散才能有效检出，同时其血浆中存在较强的抗-B和较弱的抗-A；直接测序分析发现：6号外显子第261位缺失杂合，7号外显子第297位A／G、467C／T、646T／A、681G／A、771C／T、829G／A、804insG／G杂合；克隆测序发现1个为常见的002等位基因，另1个为1种新的等位基因（已被dRBCNCBI命名为Ae抑8），与A102比较，Ael08在第804位碱基处插入G，这导致氨基酸第268位后阅读框架发生改变，编码产物比正常A1转移酶多37个氨基酸。家系调查显示：先证者Ael08等位基因从父亲遗传所得。结论发现1个ABO新等位基因Ael08，α-1，3-N．乙酰半乳糖胺基转移酶基因（A基因）第804位碱基处插入G突变导致产生Ael表型。

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因742C>T突变导致A2亚型

本研究探讨2例ABO亚型A2B的分子机制。利用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原,用标准A、B、O细胞检测先证者血清中的ABO抗体,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增先证者ABO基因的第5至7外显子序列,其PCR产物经酶切后直接测序分析。同时,PCR产物经TOPO TA克隆到质粒载体中获得单链,对所得克隆进行ABO基因第6、7外显子双向测序分析。结果表明,先证者红细胞有A、B抗原,同时其血清中存在抗A1抗体。直接测序分析发现,第261位无缺失,第297位A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、742C/T、796C/A、803G/C、930G/A杂合。克隆测序得到B101和1个新的A等位基因。与A102相比,新A等位基因仅在第742位C→T突变,导致第248位精氨酸变成色氨酸,新等位基因已被正式命名为A213。结论 :α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因第742位C→T突变导致产生A2表型,表型个体血清中可含有抗A1抗体。

ABO血型新等位基因O61的分子生物学研究

本研究探讨ABO新等位基因O61的分子机制。利用单克隆抗体检测标本红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测标本血清中的ABO抗体。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增ABO基因的第5至7外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析6和7外显子。1例B表型标本采用基因组单链抽提技术分离杂合基因型标本的2条单体型,对分离的单体型扩增后进行ABO基因测序分析。结果表明,在417例标本中发现3个标本743位碱基发生突变,其中2例表型为O型,1例为B型。2例O型直接测序分析显示,6和7外显子有261G缺失及743G/C杂合。1例B型直接测序结果为261G/缺失及297A/G、526C/G、743G/C、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A杂合。采用基因组单链抽提技术将B型标本的两条单体型进行分离,对分离的单体型扩增后进行ABO基因测序分析,结果显示,2条链分别为B101和突变的O型。将突变的新O型基因提交血型抗原基因突变数据库,被正式命名为O61。结论:ABO基因7号外显子743G>C为1个新的突变点,发现1个ABO新等位基因O61。

铝、氟及其复合处理对茶树根际土壤酶活性的影响

研究了铝、氟及其交互作用对白茶和智仁早茶根际土壤酶的生态效应。结果表明,在单独施铝处理中,脲酶和多酚氧化酶活性受到抑制,其它土壤酶活性均随铝浓度的升高呈现先升后降的趋势,当Al浓度高达400mg/kg时,对酶呈现出抑制作用,影响达显著或极显著水平;在单独氟处理下,磷酸酶、尿酸酶活性变化不大,随着氟浓度的升高,除多酚氧化酶活性受抑制外,其余的酶活性也呈现出先升后降的趋势,当F浓度高达120 mg/kg时,对酶产生抑制作用,总体上氟的影响不如铝显著;铝、氟复合处理条件下,铝与氟之间联合作用对脲酶、蛋白酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、尿酸酶和抗坏血酸氧化酶活性产生了显著或极显著的交互效应,其作用方式因铝、氟处理浓度组合、酶及茶树品种的不同而不同。研究还发现,铝、氟对茶树根际土壤酶的交互效应与铝氟浓度的比值有密切关系,且不同的酶活性达最高时的铝氟比值基本相同,表明在茶树体内代谢中铝、氟之间存在一定的相关性。根际土壤酶活性在两个茶树品种间存在较大的基因型差异,尤其以酸性磷酸酶和抗坏血酸氧化酶最为显著,总体上白茶根际土壤酶对铝、氟及其交互作用较智仁早茶更敏感,两茶树品种之间土壤酶活性的差异与茶树根际过程密切相关。

RHD基因不同转录子表达载体的构建

RHD基因存在多种不同的另路剪接的转录子,本研究分别构建正常mRNA及DEL9和DEL89转录子的表达载体。从Rh(D)阳性新生儿脐血网织红细胞中提取总RNA,分别采用一步法和两步法RT-PCR获取完整目的转录子片段,然后分别克隆至pCR4 TOPO测序载体并测序验证和筛选。用正常RHD cDNA筛选质粒为模板,PCR扩增全长目的基因,然后亚克隆至pcDNA3.1/V5-His TOPO表达载体;DEL9和DEL89转录子直接克隆至表达载体,通过测序验证目的基因序列及插入方向。结果表明,序列分析证实了不同目的基因片段序列和方向正确,表明3种不同RHD转录子的表达载体构建成功。结论:RHD不同转录子表达载体已成功构建,为进一步研究Rh(D)抗原膜表达机理奠定了基础。

mica基因的克隆及其在原核系统中的表达

本研究构建mica基因原核表达系统并纯化MICA蛋白。利用外周血标本提取RNA,经RT-PCR获取mica基因cDNA。将mica cDNA经TOPO克隆连接构建克隆载体,然后将克隆重组载体和原核表达载体pET-28a经双酶切后进行连接构建重组表达载体,进而转染宿主菌E.coliBL21DE3进行表达。利用亲和层析的Ni-NTASpin纯化重组的MICA蛋白。结果表明:带有重组质粒pET-28a-mica的宿主菌经IPTG诱导表达后,以可溶性形式大量表达重组的MICA蛋白,经Ni-NTA Spin纯化后得到重组的MICA蛋白。结论:本研究构建了mica基因原核表达系统并纯化了MICA蛋白,为探讨MICA与移植免疫的关系奠定了基础。

KIR2DL1基因多态性及其抗原表达关系的研究

目的本研究拟建立KIR2DL1基因分型和抗原分型技术,了解中国汉族人群KIR2DL1基因分布和抗原表达情况。方法收集166份新鲜外周血标本,分离单个核细胞,利用NK细胞特异性的CD56,和KIR2DL1特异性的CD158a抗体流式检测KIR2DL1抗原表达情况。提取标本的基因组,利用PCR-SSP技术检测KIR2DL1基因的有无,对于KIR2DL1基因阳性标本设计3对引物扩增1～9号外显子,并进行全长测序分析。结果1)166份标本中,164份标本KIR2DL1阳性,其中62份标本KIR2DL1和KIR2DS1双阳性,仅2份标本KIR2DS1单阳性。

KIR3DL1基因多态性及抗原表达关系的研究

目的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immuno-globulin-like receptors,KIR)可与靶细胞表面的HLA分子结合,调节NK细胞和T细胞的活性。本研究拟建立KIR3DL1基因分型和抗原分型技术,了解中国汉族人群KIR3DL1基因分布和抗原表达情况,为今后器官移植选择合适供者提供KIR相关的参考依据。方法收集新鲜外周血155份,采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,利用NK细胞特异性的CD56和KIR3DL1特异性的NKB1抗体流式检测KIR3DL1抗原表达情况。采用商品化试剂提取155份标本的基因组DNA,利用PCR-SSP方法检测KIR3DL1阳性标本,

1种用于分析疾病相关ABO抗原丢失的染色体杂合性缺失方法

目的建立1种9号染色体杂合性缺失(LOH)的分析方法,以解释因ABO基因附近染色体的LOH导致的疾病相关ABO抗原丢失现象。方法在9号染色体长臂和短臂上共选取13个微卫星位点,其中10个位点(D9S1677、D9S289、D9S1776、D9S1682、D9S290、D9S164、D9S1818、D9S1826、D9S158、D9S1838)位于ABO血型基因近端,平均间距5.52 cM;另3个位点(D9S1858、D9S171、D9S1843)位于ABO基因远端,平均间距39.3 cM。分别设计合成FAM和HEX荧光标记引物,优化PCR扩增后,以聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳,通过GeneMapper软件分析微卫星不稳定性,观察染色体LOH发生情况。结果 13个微卫星位点均得到了较好的PCR扩增效果,PCR产物长度在75～273 bp之间,各位点均有较高的杂合度,适合于微卫星片段长度分析。13个位点可在2个泳道中进行双荧光同步分析,各位点不同等位基因间互不干扰。分别对1例正常血型标本和2例血液病相关的ABO抗原变异标本(包括口腔黏膜DNA和外周血DNA)进行微卫星分析,正常血型标本的口腔DNA和外周血DNA未发现染色体LOH现象。而2例ABO抗原变异标本,与口腔黏膜DNA相比,外周血DNA均存在不同程度的LOH现象,表明ABO抗原丢失可能源于血液系统疾病相关的9号染色体LOH现象。结论建立了1种基于微卫星不稳定分析的9号染色体LOH方法,可用于血液系统疾病相关的ABO抗原丢失标本分子机制的研究。

新一代信息技术在血站后勤管理中的应用和探索

运用物联网、大数据、人工智能、5G等新一代信息技术,创新工作思路,与血站业务深度融合,使血站管理能力能力更精细和更智慧,为血站工作的正常运转提供强有力的后勤保障,在推进智慧化血站建设方面做出努力。基于RFID技术结合血站自身特点建立血站智能化资产管理系统,从而实现对血站设备的智能化管理。通过物联网联合人工智能血站的改变后勤仓库管理模式,结合采集物资的采购周期、历史消耗量、实时消耗量、最低库存量等一系列的数据,可以建立数据模型,最终建立一套可视化的智能管理模式,实现物资分配科学合理性和效益最大化。多种新一代的信息化技术的综合应用,提升了后勤管理效率,加强了后勤管理的力度,为血站工作的正常运转提供强有力的后勤保障,推进血站智慧化管理。

ABO基因c.398T>C新变异导致Bweak表型的分子特性研究

目的探讨1例Bweak亚型个体的分子机制。方法选取2016年12月5日于浙江省血液中心献血的1例受试者为研究对象。利用血清学方法鉴定受试者的ABO表型,用体外酶活性试验测定其血清中B糖基转移酶(GTB)的活性。用PCR扩增ABO基因第5~7外显子及侧翼序列并确定其基因型,采用T-A克隆技术分离单倍体并进行测序验证。用ProtParam和PSIPRED软件分析蛋白的一级理化性质和二级结构。用PolyPhen-2、SIFT、PROVEAN三种软件分析错义变异对蛋白的作用效应。结果受试者血清学检测为Bweak亚型,血清中存在抗B抗体。体外酶活性试验显示其GTB活性显著降低。单倍体克隆测序分析发现B等位基因上存在c.398T>C错义变异,为一个新的B等位基因,可导致GTB第133位的苯丙氨酸替换为丝氨酸(p.Phe133Ser)。生物信息学分析提示上述替换对蛋白的一级和二级结构影响不明显,但变异蛋白的热力学能量增加6.07 kcal/mol,严重降低了热稳定性,生物信息学预测该变异对蛋白功能有害。结论新等位基因ABO*B.01-398C是引起Bweak亚型抗原弱表达的机制,生物信息学分析有助于评估其结构和功能的变化。

一例ABO血型系统B抗原减弱表达的分子机制

目的研究1例B抗原减弱献血者的血清学特性和抗原减弱的分子机制。方法应用单克隆抗体检测献血者红细胞ABO血型抗原，标准A、B、O红细胞检测其血清中的ABO抗体，并检测其血清转移酶活性。采用聚合酶链反应技术扩增ABO基因全部外显子序列和5′端非编码区序列并进行测序分析，应用逆转录-PCR和克隆测序技术分析献血者ABO cDNA转录剪接情况，采用重亚硫酸盐转化直接测序法分析ABO基因启动子区CpG岛甲基化水平。结果献血者血清学表现为B抗原明显减弱，血清中无抗-B抗体，B转移酶活性降低。基因型为B101／O01，全部外显子序列和拼接接受位点碱基无任何突变。5′端非编码区序列多态性符合B101／O01的特征，启动子、增强子、负调控序列和微卫星重复序列未发现异常。献血者存在ABO基因全长cDNA转录本，未发现新的转录剪接体。与正常对照标本比较，在启动子区CpG岛内发现启动子附近有多个特异性半甲基化位点。结论启动子区CpG岛中的甲基化位点可能是引起B抗原弱表达的原因。