重组人睫状神经营养因子突变体的构建、表达及生物活性分析

目的:通过对原始CNTF的突变改造,降低表达蛋白的免疫原性,同时增加其稳定性,以期能用于临床治疗肥胖症。方法:以原始CNTF为模板,去掉N端的12个氨基酸、C端的14个氨基酸,并将C端末2个氨基酸点突变为极性较强的赖氨酸,在大肠杆菌中表达,获得CNTF-T突变体。结果:基因序列分析与原设计吻合,目的蛋白表达量占全菌体的35%左右,表达蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性、DEAE-FF纯化,纯度可达95%以上,小鼠体内生物活性测定,能明显抑制小鼠体重增长,且CNTF-T的生物活性比原始序列CNTF的活性高。结论:突变的CNTF-T有望成为新一代的生物减肥制剂应用于临床。

重组人戊型肝炎疫苗细菌内毒素检查方法的建立

确立重组人戊型肝炎疫苗原液的细菌内毒素检查方法。供试品参照《中华人民共和国药典》(2005年版三部)热原检查法进行热原检查,结果符合规定。该供试品同时参照《中华人民共和国药典》(2005年版三部)细菌内毒素检查法要求进行试验。供试品溶液在40μg/m l浓度下,确定内毒素限值为40EU/m l。供试品在该内毒素限值下干扰试验有效,且细菌内毒素检查法符合规定。该疫苗用内毒素检查法代替热原检查法,方法可行。

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）的工程菌表达产物进行纯化，经过超声破碎，包涵体抽提，凝胶层析，复性，离子交换一系列纯化步骤，终产物纯度达９８％，比活性达１０００００００ｕ／ｍｇ。

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。

采用一种新介质纯化神经生长因子

采用一种新离子交换介质Express IonC(简称IonC)使鼠神经生长因子 (mNGF)能得到规模纯化。以鼠颌下腺为原料 ,匀浆后 ,经Express IonC纯化得单一组分的mNGF ,用SDS PAGE测定其相对分子质量约为 13.7× 10 3,比活约 2 .3× 10 5U mg。结果表明IonC可替代CM 5 2 ,且更适于神经生长因子的规模化生产。

乙型肝炎表面抗原基因DNA介导的体液免疫初步研究

用ＰＣＲ技术从纯化的乙型肝炎病毒核酸中扩增出ｐｒｅＳ２－Ｓ基因，并将其定向克隆于真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中，构建成带有完整的乙肝表面前Ｓ２抗原基因和Ｓ基因的重组质粒．重组质粒经酶切及部分序列分析鉴定后，瞬时转染小鼠Ｌ细胞，ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清液有ＨＢｓＡｇ表达．用纯化的重组质粒静脉、肌肉和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，首次接种质粒ＤＮＡ３周后，血清抗体开始出现，再次加强２周后，阳性率明显提高．

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。

四种金属离子亲和层析纯化重组戊型肝炎病毒包涵体的效果比较

目的 选择固相金属亲和层析柱的金属离子,以优化分离纯化重组戊型肝炎病毒包涵体的条件。方法 在同一试验条件下用4种金属离子柱分离纯化目的蛋白。结果 包涵体经不同离子柱层析时目的蛋白的收获率、纯度、洗脱条件各异。结论 镍离子柱纯化效果最佳。

重组鼠疫菌V抗原的纯化及其豚鼠免疫保护力初探

采用Ni2 +亲和层析方法 ,对用工程化大肠杆菌BL2 1(DE3)表达的重组鼠疫菌V抗原进行纯化 ,目标蛋白纯度达到 90 %以上。以氢氧化铝凝胶配制吸附疫苗 ,经二针次肌内注射免疫实验豚鼠后 ,对皮下注射 4 0 0个致死剂量 (MLD)强毒鼠疫菌攻击有一定保护效力 ,存活率为 2 0 %。结果表明 。

重组人睫状神经营养因子的聚乙二醇化修饰

目的:研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)突变体的聚乙二醇(PEG)化修饰,对rhCNTF的PEG化产物进行初步分离纯化及相关生物活性检测。方法:采用分子生物学技术经点突变得到rhCNTF的突变体CN10,通过实验设计研究CN10的最佳PEG化条件;采用分子筛层析方式对偶联产物进行初步纯化,最后用ELISA和小鼠体重增长抑制法检测PEG化后的CN10蛋白的生物活性。结果:能运用mPEG-MAL对CN10进行定点修饰,PEG化后用Superdex200能够分离CN10;PEG化后的CN10每2 d腹腔注射1次,对小鼠体重的增长抑制率可达50%,与rhCNTF每天注射2次的体重增长抑制作用相当。结论:CN10蛋白在PEG化修饰后,其减重效应持续时间明显延长。

凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子中细菌内毒素含量

目的采用凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子(CNTF)中细菌内毒素含量,控制制品质量,消除临床热原反应的发生。方法供试品参照《中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录ⅫE细菌内毒素检查法中的凝胶法和动态浊度法要求进行检查。结果注射用重组人睫状神经营养因子溶液在100μg/mL质量浓度下,确定内毒素限值为10 EU/mL。凝胶法和动态浊度法检查后,注射用重组人睫状神经营养因子内毒素含量均符合规定。结论凝胶法和动态浊度法可用于注射用重组人睫状神经营养因子的细菌内毒素检查。

重组铜绿假单胞菌外毒素结构域Ia片段的佐剂功效研究

采用分子克隆技术,将铜绿假单胞菌PA103株编码的外毒素结构域Ia(DomainIa)的基因重组于原核表达载体pET42b(+)上,构建了pETEPA103蛋白表达载体。转化感受态大肠杆菌DE3。经IPTG诱导表达,初步纯化表达蛋白,用以免疫BALB/c纯系小鼠。制备小鼠脾淋巴细胞悬液,经刀豆素A(ConA)刺激后,用MTT比色法检测特异性淋巴细胞增殖反应。通过rEPA皮下注射BALB/c小鼠耳廓,诱导小鼠迟发型过敏反应(DTH)。采用特异性淋巴细胞增殖反应和DTH试验来检测pETEPA103表达蛋白所引起的小鼠细胞免疫应答水平,淋巴细胞增殖情况与DTH均可间接反映细胞免疫应答水平,进而评价重组铜绿假单胞菌外毒素(rEPA)DomainIa蛋白片段的佐剂功效。

神经生长因子制备工艺的改进及有关问题的讨论

为了达到规模化生产的目的 ,本文在神经生长因子制备工艺前增加了去脂处理 ,省略了CM (I)柱前的透析 ,并对影响生产收量的因素进行了探讨 ,使实验室结果得以有效放大 ,每 2 0 0 0对鼠颌下腺可提取蛋白 91mg ,总活性达 6 9× 10 7Bu。

等电聚焦法测定2.5S NGF的等电点

采用水平等电聚焦法测定了２５Ｓｍ神经生长因子（ＮＧＦ）的等电点。经测定，纯化的２５ＳｍＮＧＦ的等电聚焦为三条带，这与文献报道相一致，等电点ｐＨ值分别为ｐＨ８７、９０、９３，其主要成分为β亚基ＮＧＦ及其修饰物的混合物，包括在羧基端失去８个氨基酸残基和在氨基端失去１个精氨酸残基，由这三种组分构成的ＮＧＦ统称为２５ＳｍＮＧＦ。

注射用鼠神经生长因子研制

神经生长因子(NGF)是一类能促进神经生长的多肽类生物活性特质.国内外许多研究证实NGF具有维持交感神经和感觉神经的生存、影响中枢神经元生长、促进神经细胞的分化、判定轴突生长等方面的生物学功能.我们把鼠神经生长因子作为一种非常有希望的临床药物进行开发,作为国家一类新药进行申报,其完成研究资料40余项,分为生产工艺和检定方法、稳定性试验、临床前药理、临床研究等四个方面.

细菌培养基中营养物质的代谢及优化方法

细菌培养基是细菌体外生长的基质,其中营养物质是细菌生长、繁殖的基本成分。因此,探索培养基中营养物质的代谢,优化培养基配方,对细菌体外培养的研究及规模化生产有着重要的指导意义。现就细菌培养基分类、营养物质、细菌在营养物质中的代谢及培养基优化方法等方面予以总结。

人肿瘤坏死因子-α突变体在大肠杆菌中的表达及活性测定

目的构建一种新型人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）分子，测定其蛋白表达和生物学活性。方法在详细分析ＴＮＦα结构及其结构与功能关系的基础上，设计并人工合成了一对ＴＮＦα结构基因点突变引物。应用ＰＣＲ分子克隆技术构建了一种新型ＴＮＦα分子的编码基因，将该编码基因插入表达质粒，转化大肠杆菌，通过温度诱导获得了表达蛋白，对表达产物进行免疫学检测和生物活性检测。结果新构建的突变体ＴＮＦαΝ１与ＴＮＦαＥＬＩＳＡ试剂盒有免疫学反应，其含量为０．５μｇ／ｍｌ；在体外有生物学活性，为１０７ＢＵ／ｍｌ，比活为２．１×１０５ＢＵ／ｍｇ；理化性质与天然原型ＴＮＦα有所不同。结论得到了一种具有生物学活性的新型ＴＮＦα分子。

基因重组人肿瘤坏死因子-α突变体的构建

在详细分析ＴＮＦα结构及有关ＴＮＦα结构与功能关系研究的基础上，设计并人工合成了一对ＴＮＦα结构基因点突变引物。应用ＰＣＲ和分子克隆技术构建了一种新型人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）分子的编码基因，将该编码基因插入表达质粒，转化大肠杆菌，通过温度诱导获得了表达蛋白，对突变体克隆进行了ＤＮＡ电泳、酶切位点检测以及基因序列测定，并对突变体蛋白进行了ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测。

包涵体蛋白复性技术研究进展

本文对原核表达的包涵体蛋白的分离,洗涤,溶解及复性方法做了一个简单的总结。同时就国内外近几年的最新复性方法进行了概述。并分析了各种复性方法的利弊。