羰基还原酶的克隆、异源表达及其在(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯合成中的应用

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是合成血管紧张素转换酶抑制剂类降压药的关键手性中间体。筛选了1株具有不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯活性的野生菌DY99,经鉴定此菌为Kazachstania naganishii。从该菌基因组序列中挖掘并克隆了发挥催化活性的羰基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coli-pET28-kncr,对其诱导表达条件和催化反应条件进行了优化,并在最适条件下进行了催化反应。结果发现:在最优条件(当OD 600达到0.8时,添加乳糖6 g/L,在28℃、150 r/min诱导12 h)下,重组菌酶活达到330.61 U/L发酵液。确定了全细胞催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的最适反应条件为30℃,pH7.5,底物、葡萄糖、细胞生物量分别为15、15和20 g/L(以干质量计),在最适反应条件下,产物累积量、时空产率分别为11.2 g/L和26.88 g/(L·h),产物的对映体过量值(e.e.)>99%,显示了良好的应用前景。