等离子体-紫外线复合诱变选育高产谷胱甘肽酵母菌

以产还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-20为出发菌株,采用氩气等离子体射线、紫外照射及两者的复合诱变处理,获得一株高产GSH的酿酒酵母优良菌株(S.cerevisiae)DU-20.结果表明该菌株具有稳定的遗传性能,GSH含量与产量分别比出发菌株提高了78.33%和118.4%.

新型冠状病毒Beta株灭活疫苗原液鉴别实验

目的建立特异性鉴别新型冠状病毒Beta株灭活疫苗原液的逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)并验证。方法在新型冠状病毒Beta株刺突蛋白(spike, S)受体结合域(receptor binding domain, RBD)中3个特异性突变位点的上下游保守区域设计引物S3F/S3R, 通过RT-PCR扩增843 bp目的DNA。对扩增产物进行测序, 与原型株的S基因序列进行对比, 通过3个特征突变识别Beta株。对该方法的重复性、专属性、耐用性和灵敏度进行验证。结果该方法能准确扩增出843 bp目的DNA, 经测序表明, 扩增产物与新型冠状病毒Beta株基因序列一致, 包含3个特征突变位点。取1批Beta株原液进行6次PCR, 测序结果显示与Beta株核苷酸序列一致。S3F/S3R引物只对S的RBD区域有扩增作用。Beta株原液4 ℃和-70 ℃放置8周, 仍然可以扩增出目的条带, 且测序结果正确。将原液提取RNA稀释成不同浓度后进行RT-PCR, 得出最低检测限为0.032 ng/μl。结论建立的RT-PCR具有良好的专属性、重复性、耐用性和灵敏度, 能成功区分新型冠状病毒原型株与Beta株, 可用于新型冠状病毒疫苗生产中原液的鉴别。

狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测的优化及验证

目的对狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测(direct immunofluorescence assay,DFA)进行优化及验证,使其更好地应用于规模化生产中的质量控制。方法采用不同的病毒培养温度(35、37℃)、培养时间(24、48 h)、接种细胞(Vero细胞、BSR细胞)以及稀释倍数(3、5、10倍)对狂犬病病毒滴度进行DFA,并对病毒滴度结果进行统计学分析。对优化方法进行重复性和中间精密度验证,并对多个批次样品采用小鼠颅内滴定法和DFA进行滴度检测,分析其相关性。结果优化的条件为37℃培养24 h、接种BSR细胞、5倍系列稀释病毒。DFA重复性和中间精密度变异系数均小于2%,16份样品的小鼠颅内滴定法与DFA滴度显著相关,相关系数为0.952,且P值小于0.0001。结论优化后的DFA快速、准确,且与小鼠颅内滴定法一致性较好,能够替代后者作为狂犬病疫苗规模化生产的质量控制方法。

Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液特异性鉴别试验RT-PCR法的建立及验证

目的建立Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液特异性鉴别试验的RT-PCR法,并对该方法进行验证。方法根据GIAIDS数据库中新型冠状病毒Omicron株及其他突变株和原型株的S基因序列差异设计并合成引物OSTF1、OS1R,提取Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液病毒RNA,逆转录为cDNA,利用对Omicron株S蛋白基因序列中的特异性插入及缺失核苷酸序列设计的引物对进行PCR扩增,扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。对建立的RT-PCR法进行重复性、中间精密度、专属性、耐用性及灵敏度验证,并用该方法鉴别6批Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗原液。结果Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液利用引物OSTF1/OS1R进行RT-PCR检测,可扩增出约460 bp的条带,而原型株、Beta株、Delta株新型冠状病毒灭活疫苗原液(Vero细胞)均无法扩增出条带;重复3次检测、2名实验人员分别在3 d重复3次检测、利用3种不同退火温度进行RT-PCR,Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液均可扩增出约460 bp的条带;原液蛋白浓度在0.04μg/mL以上、RNA浓度在0.128 ng/μL以上均可扩增出较亮的约460 bp的条带;6批Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液经RT-PCR检测,均可见约460 bp的条带。结论RT-PCR法专属性、重复性、中间精密度、耐用性和灵敏度均良好,可用于Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液鉴别。

二代测序在Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种遗传稳定性研究中的应用

目的分析并监测Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种遗传稳定性。方法毒种通过不同的方式,即未经过空斑纯化的毒种和空斑纯化的毒种,在细胞上进行连续传代后,收获细胞培养上清提取病毒核酸,利用二代测序进行病毒宏转录组分析,比较不同条件下Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种的全基因组突变位点及突变频率和插入/缺失的差异。结果空斑纯化毒种连续传代后,ORF1ab和S基因序列上的高于5%的突变位点明显少于未经空斑纯化的毒种,且在纯化毒种全基因组中未检测到插入/缺失突变。结论通过二代测序技术,分析不同路径的毒种连续传代样本的全基因组序列,结果表明毒种经过空斑纯化后的遗传稳定性优于未纯化毒种,为灭活疫苗研发毒种的选育提供了科学依据。