携带89K样毒力岛的猪链球菌ST665型与ST107型临床菌株的基因组及致病分析

目的明确89K样毒力岛(PAI)的基因组特征及其在猪链球菌致病及耐药传播方面的作用。方法通过生物信息学方法分析89K样PAIs的基因组特征;通过接合实验比较两种89K样PAIs的转移能力;采用最小抑菌浓度法测定临床分离株及接合子的耐药谱;通过C57BL/6小鼠和斑马鱼感染模型分别评估两个临床菌株及其89K样PAIs的接合子的致病性。结果携带89K样PAIs的猪链球菌临床菌株GX54和GX82的序列型(ST)分别为ST665和ST107。菌株GX54携带的PAI大小为75Kb,在核苷酸水平上与ST7流行型菌株携带的89K PAI具有99.21%的相似性和79.00%的覆盖率,而菌株GX82携带的PAI大小为87Kb,与89K PAI具有98.80%的相似性和86.00%的覆盖率。这两个PAIs的插入位点与89K PAI相同,均位于rplL位点,且PAIs的两端均含有一段15 bp的att序列(5’-TTATTTAAGAGTAAC-3’)。此外,这两个PAIs均具有完整的模块化结构,包含完整的NisK-NisR样双组分信号转导系统和IV型分泌系统(T4SS)。而在SalR-SalK样双组分信号转导系统中,仅SalR基因保持完整,SalK基因发生错义突变。与89K PAI相比,本研究中的两个PAIs在基因组成上呈现出一定的差异。75K PAI插入了4个基因,包括两个假定蛋白基因和两个耐药基因tet(O)和erm(B)。而87K PAI则插入了12个基因,主要涉及编码与质粒相关的重组酶和假基因,以及与耐药相关的cat、tet(L)、erm(B)基因。此外,还包括编码转座酶、拓扑异构酶等基因。菌株GX54携带的75K PAI的转移频率为4.61×10−5,显著高于菌株GX82携带的87K PAI的转移频率8.46×10^(−6)。与受体菌P1/7RIF相比,两个89K样PAIs的接合子P1/7RIF-GX54与P1/7RIF-GX82的四环素类和大环内酯类抗生素的抗性水平,以及对斑马鱼的致病力均显著增加,且两接合子组间的致病力差异无统计学意义(P>0.05)。菌株GX54和菌株GX82感染C57BL/6小鼠后,菌株GX54感染组小鼠死亡率显著高于菌株GX82感染组(P<0.05)。攻毒8 h后,两感染组小鼠的外周血细菌载量无统计学意义(P>0.05),但菌株GX54感染组小鼠血清中的TNF-α水平显著高于菌株GX82感染组小鼠(P<0.05),而IL-6水平在两感染组间无统计学意义(P>0.05)。sly、mrp、epf,ofs,revS,nadR,SSU05_0473,neuB及neuC等在高致病型猪链球菌中常见的毒力基因在GX54与GX82也存在。结论本研究首次发现了猪链球菌ST665和ST107型临床菌株携带可移动的89K样PAIs。携带不同89K样PAIs的菌株毒力水平具有显著差异,该差异与菌株在感染早期诱导宿主产生TNF-α的水平密切相关,且并非由外周血中的细菌载量差异所引起。仅以包括89K样PAIs在内的已知毒力基因存在与否做为判断猪链球菌毒力水平的方法存在不足。