HIV-1疫苗prime-boost策略免疫间隔研究

目的探索不同的DNA、重组痘苗病毒、蛋白疫苗免疫间隔在HIV-1疫苗prime-boost策略中对免疫效果的影响,为建立最佳免疫方案提供理论支持。方法对小鼠进行3针DNA初免,之后分别间隔3周、6周、12周、16周免疫重组痘苗病毒VTKgpe;对小鼠或兔子进行3针DNA初免,间隔16周免疫VTKgpe,之后分别间隔4周或8周免疫gp140蛋白。末次免疫后2周检测HIV-1特异性体液或细胞免疫应答。结果 DNA初免-VTKgpe加强间隔16周效果最佳,诱导的HIV-1 Env特异性抗体滴度达到105,分泌IFN-γ的T细胞数为5 966.4/106细胞。DNA初免,间隔16周VTKgpe加强,之后间隔4周或8周gp140蛋白加强效果差异无统计学意义。结论 DNA疫苗初免,16周后VTKgpe加强,4周后gp140蛋白加强可诱导较高的免疫应答,同时更为适宜临床试验及商业化应用的需要。

抗金黄色葡萄球菌肠毒素B保护性中和单克隆抗体的筛选及鉴定

金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)属于热毒素超抗原家族。它通过激活T细胞,使T细胞大量增殖并释放大量炎症细胞因子,从而导致中毒性休克综合征及死亡。为了筛选获得抗SEB的中和保护性单克隆抗体,我们首先克隆了SEB基因,表达纯化获得GST-SEB融合蛋白;将之免疫BALB/c小鼠后,利用杂交瘤技术结合ELISA检测,筛选获得10株抗SEB单克隆抗体杂交瘤细胞株;ELISA和Western blot鉴定其分泌的抗体能与SEB特异结合;抗体亚型检测均为IgG1/k;体外实验证实,10株抗体中有6株(1A5、4A3、3E2、3C1、1D1、2G9)能够有效阻断SEB诱导的人外周血单核细胞(PBMC)的激活,具有中和保护作用。本研究为进一步获得抗SEB的人源化单克隆中和性抗体奠定了基础。

不同片段HIV-1膜蛋白三聚体的构建、表达及其免疫原性

目的构建、表达不同片段1型人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)的膜蛋白三聚体,并检测其免疫原性。方法以中国主要流行株HIV-1CRF_07 BC亚型基因为模板构建pFUSE-gp160重组质粒,以pFUSE-gp160为模板构建pFUSE-gp140FF、pFUSE-gp120FF、pFUSE-gp41FF、pFUSE-N55FF、pFUSE-N28FF重组质粒,将重组质粒分别转染293F细胞,转染120 h后,收获上清,经Ni-NTA superflow、nProtein A SepharoseTM4 Fast Flow及Superose 12 Prep Grade分子筛纯化后,分别进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将各重组蛋白联合MF59佐剂经大腿肌肉注射免疫豚鼠,100μg/只,分别于第1、30及60天各免疫1次,初次免疫前7 d及末次免疫后第90天心脏采血,分离血清,ELISA法及假病毒系统分别检测血清特异性抗体效价及中和抗体滴度。结果质粒pFUSE-gp160、pFUSE-gp140FF、pFUSE-gp120FF、pFUSE-gp41FF、pFUSE-N55FF、pFUSE-N28FF经测序鉴定构建正确。各纯化蛋白的SDS-PAGE及Western blot鉴定均可见目的条带,gp120FF和gp140FF均可高通量表达,其表达量分别为6和2.5 mg/L,gp41FF、N55FF和N28FF蛋白的表达量均低于0.5 mg/L,纯化后的纯度均较高。gp140FF组和gp120FF组豚鼠血清抗体效价分别为3.2×105和5.33×105、中和抗体滴度分别为405和462,均显著高于其他组(P<0.05)。结论 gp140FF和gp120FF能诱导豚鼠产生较强的体液免疫反应和中和抗体,本实验为HIV-1疫苗的研发提供了参考。

HIV-1膜蛋白gp140三聚体的真核表达、纯化、鉴定

目的构建表达中国流行株HIV-1 CRF_07 B/C亚型(CN54)膜蛋白gp140及其突变体,为HIV-1疫苗设计提供优秀的免疫原。方法构建gp140、gp140 ST质粒,将质粒瞬时转染293F细胞,120h后收获上清液,经纯化、浓缩、PBS置换后,利用SDS-PAGE电泳、Western-blot检测蛋白的表达,ELISA检测其与HIV-1阳性病人血清的反应性。结果 SDS-PAGE电泳、Western-blot试验证明成功表达了gp140、gp140 ST蛋白,并且gp140 ST是一个稳定的三聚体蛋白质。ELISA试验检测,发现表达的gp140 ST蛋白与HIV-1阳性病人血清的亲和力高于gp140蛋白。结论经过突变改造的gp140 ST具有稳定的三聚体构象,可作为HIV-1免疫原进行疫苗研究。

骨桥蛋白单克隆抗体的制备及其特异性分析

为了研制骨桥蛋白(OPN)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性。本研究在毕赤酵母中表达具有良好免疫原性的重组人OPN蛋白的基础上,用重组人骨桥蛋白(rhOPN)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选杂交瘤细胞,并结合免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别的抗原位点进行分析。结果共获得4株能够识别OPN不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,3株为IgG1,1株为IgG2a。这些mAb能与重组人OPN特异性结合。本研究的四株抗体中,只有4G2B5能够检出与肿瘤转移密切相关的OPN-c的条带,预示该抗体可用于判断肿瘤预后和高转移肿瘤的临床检测。本研究成功获得了针对骨桥蛋白的特异性mAb,同时为进一步研究OPN蛋白的结构和功能提供了重要工具。

HIV-1膜蛋白gp140三聚体疫苗的构建和免疫原性研究

目的构建表达中国流行株HIV-1CRF_07B/C亚型(HIV-1CN54)膜蛋白gp140和gp140FdFc三聚体疫苗,比较其免疫原性。方法构建gp140和gp140FdFc重组质粒,将质粒分别瞬时转染293F细胞,120小时后收获上清液,经纯化、浓缩、PBS置换、BCA试剂盒检测蛋白质浓度后,利用SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量大小及纯度,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其与阳性病人血清的反应性。通过肌肉注射的方式分别免疫兔子,取兔子血清,ELISA检测血清抗体,并通过假病毒系统检测血清中和抗体滴度,比较gp140和gp140FdFc的免疫原性。结果成功获得基因重组gp140和gp140FdFc蛋白。免疫兔子后,gp140和gp140FdFc蛋白质均有很强的体液免疫应答,抗gp160抗体滴度分别为2.24×105和4.48×105,但gp140组未诱导出中和抗体,gp140FdFc组对4种假病毒具有一定的中和活性。结论 Gp140FdFc三聚体能诱导兔子产生较强的结合抗体和一定的中和抗体反应,可作为潜在的HIV-1免疫原进行疫苗研究。