脱细胞化肝脏生物衍生支架的制备及鉴定

背景:肝细胞在体外迅速失去极性及合成代谢障碍成为肝脏组织工程研究需要克服的一个难题,在体外寻找一个有利于肝细胞生长与功能维持的细胞外基质微环境成为目前研究的焦点。目的:制备肝脏去细胞化细胞外基质生物衍生支架,并对该生物衍生支架进行初步鉴定。设计、时间及地点:观察性实验,于2008-02-15/05-01在广东省脑功能修复与再生研究所完成。材料:10只雄性SD大鼠用于制备去细胞肝脏细胞外基质支架。10只雄性SD大鼠用于制备原代肝细胞。方法:将SD大鼠肝脏切成10mm×5mm的组织片后,经过胰酶-乙二胺四乙酸作用24h、去垢剂曲拉通×10072h后得到肝脏去细胞化生物衍生支架。每只大鼠获取2×108个肝细胞,将所得原代细胞与肝脏去细胞化生物衍生支架放入含DMEM-F12,体积分数为10%胎牛血清,胰岛素0.5U/mL,地塞米松1×10-7mmol/L,表皮生长因子10μg/L的培养基中共培养,并与单纯原代细胞培养相比较。主要观察指标:培养14d时组织块行苏木精-伊红染色,Masson染色进行组织学分析。并行扫描电镜观察。对培养1,3,5,7,9,14d上清液进行白蛋白及尿素水平检测。结果:组织学检查未见明显细胞核残存,大量胶原纤维得到保留,扫描电镜示纤维成网状排列。支架与原代肝细胞共培养上清液白蛋白和尿素水平高于单纯原代肝细胞培养(P<0.05)。结论:利用去垢剂与胰酶-乙二胺四乙酸低渗溶液处理可以有效完整去除肝脏组织块的细胞成分,较完整地保留细胞外基质;该生物衍生支架有利于肝细胞的生长及功能维持。

灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质的研究

目的探讨灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的可行性。方法取12周龄的Wistar大鼠的肾脏,保留输尿管、肾静脉及肾动脉,沿肾动脉插入留置针建立灌注通道。灌注压强为100cmH2O,依次灌注肝素化PBS溶液,1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,去离子水,1%TritonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液。经脱细胞处理后,采用HE染色法光镜观察及扫描电镜观察支架微观结构,DAPI染色法荧光显微镜观察残留细胞核成分。结果所有经SDS及TritonX-100联合处理后的脱细胞基质支架在HE染色光镜观察下未发现细胞残留,扫描电镜观察仅见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞,DAPI染色荧光显微镜观察未见DAPI与细胞核结合后所发出的强荧光。结论灌注法用于制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架,简便可靠,该支架无细胞成分残留,是一种理想的细胞支架。

人工肝支持系统治疗肝功能衰竭的Meta分析

目的探讨人工肝支持系统对肝功能衰竭的治疗效果。方法检索国内外1970年1月~2008年6月公开发表的人工肝治疗肝功能衰竭的相关论文,提取生存率或出院时临床好转率等可以反映远期预后的资料,以风险比(RR)为效应量进行异质性检验和统计量合计分析。结果共有12篇研究论文入选,共包含肝功能衰竭病例304例。治疗组给予机械型人工肝或生物型人工肝联合常规内科治疗。对照组均给予常规内科治疗。10篇文献讨论了人工肝对肝功能衰竭的疗效,另两篇探讨了生物肝的应用。总体而言,人工肝支持系统对肝功能衰竭的预后有一定程度的改善(RR值0.80,可信区间0.664~0.969,P值0.022),对急性肝功能衰竭的预后基本无改善(RR值0.899,可信区间0.72~1.12,P值0.361)对慢性肝功能衰竭急性加重患者的预后改善明显。(RR值0.57,可信区间为0.39~0.84,P值为0.004)。结论人工肝支持治疗对肝功能衰竭的生存率改善轻微,对慢性肝功能衰竭急性加重者明显降低死亡率。人工肝支持系统类型影响生存率。生物肝对急性肝衰竭或慢性肝功能衰竭急性加重患者都可以降低死亡率。开发生物肝支持系统应是该领域重点研发方向。

苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的实验研究

目的观察苦参碱对大规模低温冻存人胎肝细胞功能的影响。方法改良肝细胞获取方法分离人胎肝细胞,经过1h预培养后。将5种不同浓度(1×107,2.5×107,5×107,7.5×107,10×107.mL-1)的胎肝细胞以6mg/L苦参碱+5%DMSO为冻存保护液置于骨髓干细胞冻存袋在液氮中冷冻保存1个月。1个月后复苏,进行活率、形态学及功能检测。结果5种不同浓度的细胞冻存1个月后,细胞浓度为2.5×107·mL-1组复苏后存活率与其余四组相比差异有显著性(P<0.05),且明显高于其余四组。复苏后细胞存活率和24h贴壁率分别为73%,69%,经过短期培养后,细胞功能逐渐恢复。结论(1)苦参碱对低温冻存的人胎肝细胞有保护作用,与二甲基亚砜联用可降低DMSO的浓度;(2)以5%DMSO+6mg/L苦参碱作为冻存保护剂,细胞浓度在2.5×107·mL-1冻存效果最佳。该大规模冻存方法基本上可以满足生物人工肝肝细胞应用的需求。

旋转生物反应器内微载体大规模扩增肝细胞

目的评估旋转生物反应器(RCCS)内肝细胞微载体大规模培养的可行性。方法为获取足够数量活性良好的肝细胞种子细胞,本实验探索在RCCS内应用微载体技术快速扩增肝细胞的方法。将CL-1细胞和HepFMMU应用Cytodex-3微载体在RCCS内进行动态培养,观测肝细胞的生长情况和细胞代谢率。结果肝细胞在Cytodex-3微载体上生长迅速、生长倍增时间缩短,并保持很高的生物活性。培养至第5天,细胞数量可达最初接种的23倍。细胞的数量在第5天左右达到最高,然后开始下降。功能学检查、倒置显微镜、扫描电镜及MTT均提示细胞功能良好。结论RCCS微载体肝细胞大规模培养是一种可行的细胞快速扩增方法,但对于人工肝庞大的细胞数量和功能需求,应进一步研究,通过优化营养和废物排除,模拟肝脏生理结构,提高细胞培养规模和功能。

去细胞化技术在全肝生物支架建立中的应用

目的通过去细胞化技术建立保留细胞外基质的完整肝脏支架，并对支架进行形态结构和保留成分鉴定。方法通过门静脉插管，依次灌注去垢剂曲拉通X-100（Triton X-100），十二烷基硫酸钠（SDS），并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗脱残留去垢剂，对所得支架进行HE染色、门静脉及胆道铸型、扫描电镜、纤维成分染色鉴定等形态学观察。并将支架切成50μm的厚度后与C3A细胞系共培养，进行生物相容性验证。结果经本实验方案得到肝脏生物支架的成功率为75％。肝脏生物支架包膜完整，肉眼可见肝脏内Gllisson管道结构。HE染色示无细胞及胞核残存。管道铸型见胆道、门静脉完整，无铸型液溢出。扫描电镜示大量纤维网状结构存在。纤维成分染色见大量胶原纤维、弹力纤维存在。生物相容性实验初步显示该支架具备较好的生物相容性，可以作为生物支架材料应用。结论经本实验去细胞化过程，肝组织细胞可从细胞外基质中完全洗脱下来，并保留比较完整的肝脏管道系统。本研究获得全肝生物支架可以作为肝脏器官培养的基础支架。

胰腺内皮细胞共培养对C3A细胞功能变化的影响

目的 探讨与胰腺内皮细胞共培养时C3A细胞功能变化.方法 选择C3A细胞与胰腺内皮细胞的密度比例为10：1分别进行直接和间接共培养7 d,同时设立空白对照组,观察各实验组细胞生长和形态特征,分别用杜邦全自动生化分析仪、放射免疫分析法和ELISA法检测培养液中AST、ALT漏出量,白蛋白含量和安定代谢量.结果 C3A细胞与胰腺内皮细胞直接共培养第5、7天能显著降低ALT、AST的漏出量,第7天提高白蛋白合成量最高达12.977μg/ml和提高安定代谢能力;C3A细胞与胰腺内皮细胞间接共培养在第5、7天也能显著提高白蛋白合成量到7.380μg/ml、10.773μg/ml.结论 与胰腺内皮细胞直接与间接共培养均能明显改善C3A细胞的功能.