ZW10相互作用着丝粒蛋白对神经母细胞瘤增殖的影响及机制研究

目的:探讨ZW10相互作用着丝粒蛋白(ZW10 interacting kinetochore protein,ZWINT)对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞增殖的影响及作用机制。方法:利用NB数据集分析ZWINT表达水平与NB预后及临床分期的关系。EdU实验、流式细胞术和γH2AX免疫荧光染色分别检测干扰ZWINT表达对NB细胞增殖、周期分布和DNA损伤修复能力的影响。免疫组织化学/蛋白质印记(Western blot)检测MYCN扩增和无扩增组织及细胞系中ZWINT的表达情况。荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测干扰/过表达MYCN对ZWINT表达的影响。在线预测ZWINT的启动子区域MYCN的结合位点,ChIP-PCR和荧光素酶实验验证MYCN靶向调控ZWINT表达。强力霉素诱导Tet-on MYCN SH-SY-5Y细胞过表达MYCN同时干扰ZWINT表达,检测ZWINT对MYCN介导的细胞增殖、周期和DNA损伤修复功能的影响。结果:ZWINT表达水平与NB患儿总生存率、无事件生存率呈负相关,其表达随NB分期升高而增高。ZWINT干扰组NB细胞增殖明显减少,G_(2)/M期细胞比例显著增高,γH2AX焦点的形成增加。ZWINT在MYCN扩增的NB组织/细胞系中表达水平显著高于无扩增组。MYCN与ZWINT启动子区结合,干扰ZWINT表达可显著抑制MYCN对增殖的促进作用。结论:ZWINT是NB的不良预后指标,其表达受MYCN调控,干扰ZWINT表达导致MYCN扩增的NB细胞周期阻滞在G2/M期,DNA损伤修复增加,抑制NB细胞的增殖。

TMEM97蛋白对神经母细胞瘤侵袭迁移的影响及机制研究

目的探究跨膜蛋白(TMEM97蛋白)对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)转移的影响及潜在作用机制。方法从GEO和TARGET数据库中下载NB的基因测序数据,分析TMEM97与预后的关联性。免疫组织化学检测患儿NB组织和对照组织中TMEM97的蛋白表达。共表达基因富集分析预测TMEM97生物学作用,并在NB细胞株SH-SY5Y中干扰或过表达TMEM97,Transwell和细胞划痕实验检测细胞迁移和侵袭的变化,Western blot检测转移相关蛋白表达水平。分析预测TMEM97与MYCN扩增的关联性并结合荧光素酶实验检测N-myc对TMEM97转录的影响。结果TMEM97 mRNA在高危型NB中的表达量显著高于低危型,并与NB患儿总生存率、无病生存率呈负相关。TMEM97蛋白表达水平在NB组织中显著高于对照组织。TMEM97主要与细胞黏附相关,可显著促进NB细胞的侵袭和迁移能力,伴随有LMO1、GPC2、Syntenin-1和MMP9转移相关蛋白的显著上调。在MYCN扩增组织中TMEM97 mRNA表达显著高于无扩增组织,并且N-myc可以直接靶向结合启动子促进TMEM97转录,干扰TMEM97的表达可显著抑制N-myc对侵袭和迁移的促进作用。结论TMEM97是一个不良预后因素,受转录因子N-myc直接激活转录并介导NB细胞侵袭和迁移的发生。