陕西扶风某生猪养殖场肠球菌分型与毒力基因检测

[目的]分析分离自陕西扶风某生猪养殖场的肠球菌的亚型及毒力基因携带情况,为保障猪肉食品安全和临床感染治疗提供依据。[方法]采用PCR方法,对从陕西省扶风县某养殖场生猪鼻腔、粪便及其养殖场环境样品中分离到的87株肠球菌进行粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)特异性基因的扩增,根据凝胶成像中条带位置对其进行分型,检测其ace、cylA、cylB、cylM、cylL1、efaA、esp、gelE、AS、asal和hyl等11种毒力基因的携带情况。[结果]87株肠球菌中,粪肠球菌、屎肠球菌、鸡肠球菌和其他类型肠球菌(Other Enterococcus)的检出率分别为57.5%,10.3%,4.6%和27.6%;5种毒力基因asal、gelE、cylL1、ace和esp的平均检出率分别为50.6%,27.6%,19.5%,18.4%和1.2%,在猪舍地面菌株中均有检出。粪肠球菌中的asal检出率显著高于其他4种毒力基因(P<0.05),各毒力基因在未定型的其他亚型肠球菌中的检出率无显著差异(P>0.05)。在生猪育肥前期和后期,所有源菌株中毒力基因ace、cylL1、esp、gelE和asal的总检出率分别为93.7%和6.3%,82.3%和17.7%,100.0%和0%,75.0%和25.0%及84.1%和15.9%。[结论]扶风县某生猪养殖场中流行的肠球菌主要为粪肠球菌,其次为屎肠球菌和鸡肠球菌。不同来源菌株中毒力基因检出率不同,生猪育肥后期菌株中各毒力基因的检出率均有所降低。

IncI1和IncN质粒阳性沙门氏菌耐药及质粒接合转移特征

目的:研究分离于北京、上海、福建、河南、四川、广东、广西、陕西和新疆等地各类零售食品、临床病人和食品性动物源沙门氏菌中IncI1和IncN质粒的流行状况,IncI1和IncN质粒阳性沙门氏菌的药敏性、携带的耐药基因及其在接合过程的水平转移状况。方法:使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)复制子分型方法筛选携带不相容质粒IncI1和IncN的菌株,琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,PCR法检测耐药基因,膜接合法测定IncI1和IncN质粒的水平转移。结果:956株沙门氏菌中共检出IncI1阳性菌株42株(4.39%),IncN阳性菌株3株(0.31%);26株IncI1和/或IncN质粒阳性代表菌株对头孢噻呋(100.0%)、萘啶酮酸(92.3%)、氨苄西林(92.3%)、头孢哌酮(88.5%)、四环素(84.6%)、头孢曲松(80.8%)、复方新诺明(76.9%)、链霉素(76.9%)和氯霉素(61.5%)耐药最为普遍,对卡那霉素(26.9%)、庆大霉素(23.1%)、多黏菌素B(23.1%)、环丙沙星(19.2%)、阿莫西林/克拉维酸(15.4%)、头孢西丁(11.5%)和阿米卡星(3.8%)的耐药性相对较低。IncI1质粒阳性菌株比IncN质粒阳性菌株的耐药谱更宽,对头孢类抗生素的耐受水平更高;IncN质粒阳性菌株对氨基糖苷类抗生素的抗性相对更高。IncI1阳性菌株中blaTEM和blaCTX-M基因检出率高于IncN阳性株,IncN阳性株中qnrA、qnrB和qnrS基因检出率高于IncI1阳性菌株。沙门氏菌作为受体时接合频率在3.2×10^-5~2.0×10^-3之间,大肠杆菌作为受体时接合频率在8.7×10^-7~9.6×10^-5之间。供体菌携带的qnrB、acc(6’)-Ib、blaTEM和blaCTX-M基因均可通过接合转移至受体菌,接合后受体菌获得卡那霉素、头孢噻呋、头孢曲松、氨苄西林、链霉素和庆大霉素抗性。结论:IncI1和IncN质粒阳性沙门氏菌检出率较低,菌株携带的质粒类型和相应的耐药表型存在一定关联,质粒携带的耐药基因可通过接合作用在不同种属细菌间传播,使受体菌获得耐药性。

基于16S rDNA序列、MALDI-TOF-MS和VITEK的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的鉴定

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌广泛存在于食品及环境中,对食品安全造成一定的威胁。在食源性致病菌检测过程中,选择合适的方法不仅可以缩短时间,节省人力物力,还能更好地溯源。选取210株沙门氏菌和18株金黄色葡萄球菌,使用16S rDNA序列测定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和VITEK全自动细菌鉴定系统对其鉴定,使用R软件包(v3.6.1)对鉴定结果进行统计和相关性分析,比较3种方法的鉴定水平和效率。结果表明:3种方法均可将210株沙门氏菌(100.0%)鉴定到属水平;16S rDNA序列测定方法可将18株(100.0%)金黄色葡萄球菌鉴定到属水平,可将其中15株(83.3%)菌鉴定到种水平;MALDI-TOF-MS和VITEK可将18株金黄色葡萄球菌(100.0%)鉴定到种水平。除16S rDNA序列测定方法外,其余2种方法对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的鉴定水平相同,而MALDI-TOF-MS鉴定所需时间最短、效率最高。

沙门氏菌中与萘啶酮酸和环丙沙星抗性相关基因及突变的检测分析

目的:研究与萘啶酮酸和环丙沙星抗性相关基因在分离于陕西、新疆和广东等9省(市)食源性沙门氏菌中的分布及其与菌株耐药表型间的相关性。方法:使用玻片凝集法鉴定沙门氏菌的血清型,琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,聚合酶链式反应法测定9种耐药基因。结果:814株沙门氏菌共涵盖83种血清型,其中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,24.08%)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis,19.41%)、印第安纳沙门氏菌(S.indiana,13.27%)和德比沙门氏菌(S.derby,5.16%)等血清型比较常见。553株(67.94%)和219株(26.90%)沙门氏菌分别对萘啶酮酸和环丙沙星耐药。814株沙门氏菌中,oqxB阳性菌株的平均检出率(31.82%)显著高于qnrA(24.94%)、oqxA(24.57%)、qnrB(24.45%)、qnrS(10.32%)和qepA(3.07%)阳性菌株检出率(P<0.05),与aac(6’)-Ib阳性菌株的检出率(27.52%)间无显著性差异。7种耐药基因在5种最常见血清型、不同采样地来源、不同地域来源以及不同样品来源菌株中的检出率间存在一定差异。gyrA中共检出221个氨基酸突变点,以Ser83Phe/Asp87Gly双突变(21.27%)最为常见,其次分别为Ser83Phe(16.29%)、Asp87Gly(13.57%)、Ser83Tyr(12.22%)、Asp87Tyr(11.31%)、Asp87Asn(10.41%)、Ser83Phe/Asp87Asn双突变(9.95%)、Ser83Tyr/Asp87Gly双突变(2.71%)、Asp87Val(0.90%)、Gly75Phe(0.45%)、Asp87Asn/Ile89Val双突变(0.45%)和Asp87Asn/Val90Gly双突变(0.45%);parC中共检出217个突变点,以Ser80Arg(64.49%)突变最为常见,其次分别为Thr57Ser(35.05%)和Ser80Arg/Gly72Phe双突变(0.47%)。结论:陕西等9省(市)食源性沙门氏菌血清型种类繁多,对萘啶酮酸和环丙沙星耐药较为普遍,oqxA、oqxB、qepA、qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib基因比较流行,在gyrA和parC中检出多种变异,这些基因的存在和抗生素靶位变异可能是导致沙门氏菌耐药的重要原因。

β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测用质粒标准样品研制

目的研制可作为β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测质控用标准样品。方法通过检索美国国家生物技术信息中心基因库,获得β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因bla_(TEM)、bla_(PSE)、bla_(CTX-M)、bla_(CMY)和bla_(OXA)的DNA序列,构建耐药基因重组质粒和工程菌。将工程菌传代培养15代,同时使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和DNA测序测定确认目标基因的遗传稳定性。大量制备菌悬液,提取重组质粒,真空干燥得到质粒标准样品。使用PCR和定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)检测质粒标准样品的最低检出限。使用超微量分光光度计测定质粒标准样品的质量,RT-qPCR测定质粒作为模板扩增时的循环数(cycle threshold,Ct),以此评价标准样品的均匀性及贮藏稳定性。结果5种重组质粒DNA可在工程菌中稳定遗传且无突变发生,5种质粒DNA标准样品均匀性良好。各质粒DNA经梯度稀释后,PCR最低检出限在2.33×10^(4)~2.25×10^(6)拷贝数/μL之间,RT-qPCR最低检出限在1.93~1850拷贝数/μL之间。样品在37℃贮存14 d、4℃贮存3个月、-20℃贮存12个月稳定性良好。结论研究制备得到的β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测用质粒标准样品的目的基因遗传稳定性、标准样品的均匀性和贮存稳定性均良好。