植物防御素及其研究进展

植物防御素是一类小肽物质,具有很广的抑菌谱。本文对植物防御素生物学特性、产生机理、空间结构以及作用机理进行了综述,并简述了其研究意义和应用前景。

黄瓜花叶病毒辣椒分离物侵染性克隆构建

【目的】鉴定引起辣椒产生褪绿黄化症状的病原物,构建侵染性克隆。【方法】大田辣椒样品通过ELISA检测,结合病毒外壳蛋白SDS-PAGE及病毒RNA分析,初步确定辣椒中病原物为黄瓜花叶病毒(CMV)Phy株系。以辣椒病毒粒子RNA为模板,采用含T7启动子的不同正向引物通过RT-PCR扩增CMV-Phy全长基因组RNA1、RNA2和RNA3。PCR产物经过双酶切后连接到pUC118载体,并分别比较5种(DH5α、HB101、JM109、LE392和NM522)感受态细胞的转化效率。体外转录CMV-Phy的基因组cDNA克隆(pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3)成RNA分子(P1P2P3),分析其转录效率和侵染活性。P1P2P3与CMV的卫星RNA进行假重组,进一步确定CMV-Phy侵染性克隆的成功构建。【结果】引起辣椒产生褪绿黄化症状病原物为CMV,携带卫星RNA;心叶烟接种辣椒病毒粒子后同样产生褪绿黄化症状。HB101感受态细胞最适合CMV-Phy基因组转化。CMV-Phy基因组及其卫星RNA的大小如下:RNA1为3356nt、RNA2为3048nt和RNA3为2220nt,卫星RNAPz-satRNA为384nt(序列登陆号分别为:DQ402477,DQ412731,DQ412732EF363688)。CMV-Phy的cDNA克隆体外转录在5′端添加G有利于提高转录效率,但影响其侵染活性;P1P2P3在苋色藜和心叶烟产生的症状与其病毒粒子产生的症状相一致。除了Pz-satRNA,P1P2P3还能作为T1-satRNA、Rs-satRNA和Tsh-satRNA辅助病毒;T1-satRNA可加重CMV-Phy在心叶烟症状反应,而其它3个卫星RNA则对此起减弱作用。【结论】以病毒粒子RNA为模板,采用touch-upPCR扩增参数在1个反应管中同时获得CMV-Phy基因组RNA1、RNA2和RNA3;CMV-PhyRNA1、RNA2和RNA3的5′端添加1个G最有利于侵染性克隆构建。

黄瓜花叶病毒CB7株系引起心叶烟坏死反应与RNA2相关

采用RT-PCR获得黄瓜花叶病毒CMV-CB7株系全长基因组cDNA,经克隆测序发现该CMV的RNA1、2和3分别为3356nt、3045nt和2218nt(序列登录号为:EF216866、DQ785470和EF216867).CMV-CB7基因组cDNA克隆体外转录RNA接种心叶烟引起坏死症状,而CMV-Fny则产生典型花叶.由CMV-CB7和CMV-Fny基因组RNA相互交换而构建6个假重组型病毒(C1C2F3、C1F2C3、F1C2C3、F1F2C3、F1C2F3和C1F2C3)活性分析表明:CMV-CB7基因组RNA2决定其在寄主上的症状反应.嵌合型RNA2(RNA2F5C3和RNA2C3F5)的寄主侵染活性测定表明:2b基因或RNA23′端非编码序列决定CMV-CB7在心叶烟坏死症状.RNA印迹分析结果显示:CMV-CB7和CMV-FnyF5C3引起寄主坏死与基因组RNA积累没有直接关系.

2株黄瓜花叶病毒卫星RNA的cDNA克隆及序列分析

在辣椒上获得2株黄瓜花叶病毒卫星RNA(CS1和CS2), 通过cDNA克隆和测序并将其与35个已知的卫星RNA序列进行同源比较.结果表明,CS1和CS2的全长序列分别为336,382 nt;与CS2、Rs和 Yns比较,CS1从第80位起有连续30多个核苷酸的缺失.由此推测,卫星RNA的二级结构也随这些核苷酸的缺失而发生了改变.将 CMV卫星RNA分为4个组,卫星RNA CS1属于中小卫星组小卫星亚组Ⅱ,CS2属于长卫星组,CS1与其他来源的卫星RNA的同源性为80.4%～93.7 %,CS2与其他来源的卫星RNA的同源性则为75%～94.8%;两者之间的序列同源性为86%.CMV卫星RNA的序列同源性和分组与卫星RNA分布的地区和寄主来源并无直接联系.

转基因番茄研究进展

概述基因工程在番茄抗病毒、抗病虫害、抗除草剂、提高耐贮藏性、抗寒性、改善风味品质和育性等遗传改良的应用。

路易斯安娜鸢尾快繁体系的建立

路易斯安娜鸢尾(Louisiana Iris),为四季常绿水生鸢尾。其花色丰富,株型挺拔美观;同时又耐湿抗旱,冬季又能保持叶色翠绿,并可净化水质,是长江中下游地区河道及湿地绿化的一种极好的花卉品种。本文主要取路易斯安娜鸢尾的茎尖组织为外植体,诱导生成丛生芽,接种于附加不同激素配比的基本培养基上,并对生根及移栽进行了实验。结果表明,培养基为Ms+1.5mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30g/蔗糖+7g/L琼脂的不定芽诱导倍数为最高(12.96);培养基为1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.3g/L AC+30g/L蔗糖+7g/L琼脂时根有利于不定根的发生(90%以上);试管苗不经炼苗直接出瓶,移栽最佳基质为泥炭,成活率达95%以上,且生长健壮,栽种一年后即可开花。

侵染上海番茄的黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的^(32)P分子标记杂交检测及分子鉴定

2004和2005年夏季,在上海郊区露天栽培的番茄地出现典型的病毒病危害,并造成严重的产量损失。分别以32P标记的CMV基因组RNA3部分序列和卫星RNA的cDNA探针对自然感病的番茄叶组织和提纯的病毒粒子中提取的总RNA进行杂交检测,确定以上植物组织和病毒粒子中均具有CMV及卫星RNA。dsRNA分析确定自然感病叶组织中具有典型黄瓜花叶病毒(CMV)基因及其卫星RNA条带。以常规引物对感病植物的总RNA进行RT-PCR扩增,获得CMV RNA3全长克隆,经测序显示该RNA3序列属于CMV亚组Ⅱ;通过在卫星dsRNA两端分别加上15nt的单链DNA接头,以接头互补序列为引物进行扩增获得一个383nt的卫星RNA的全长序列。同源性分析结果显示其与已报道的CMV卫星RNA同源性为72.6%~99.5%,但其3′末端存在多个碱基的突变。根据同位素杂交检测及分子鉴定,CMV及其卫星RNA变异类型在上海自然感病番茄上发生和普遍存在,可能对病害流行和新的症状出现产生影响。

黄瓜花叶病毒卫星RNA T1株系的功能研究

采用RT-PCR在(cucumber mosaic virus,CMV)侵染番茄(Lycopersicon esculentum)中获得一卫星RNA(T1sat,登陆号DQ785472)。以CMV-Fny作为T1sat辅助病毒,CMV-Fny和CMV-Fny+T1sat分别接种烟草(Nicotiana tabacum)和番茄2种寄主植物。接种3 d后,RT-PCR检测寄主系统叶中卫星RNA发现,T1sat均存在于烟草和番茄中,处理寄主的总RNA电泳分析结果也表明:以CMV-Fny为辅助病毒,T1sat在烟草和番茄中均能高含量积累。其中T1sat减轻CMV-Fny在烟草中症状,而CMV-Fny与T1sat混和接种则引起番茄产生坏死症状。接种7 d和14 d后,采用Realtime RT-PCR分析T1sat对这2种寄主中CMV-Fny各基因组影响的结果显示,T1sat均减少烟草和番茄中病毒基因组的含量,但在番茄中T1sat的抑制效应比在烟草中明显。本研究结果提示:T1sat分别减轻和加重CMV-Fny在烟草和番茄中的病毒症状反应,且T1sat均降低CMV-Fny在烟草和番茄中的基因组含量。

黄瓜花叶病毒反式遗传复制体系的构建

为了确定复制酶1a在寄主植物中的含量对黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)基因组复制的影响,在本氏烟中瞬时表达CMV复制酶1a和2a,构建CMV的反式复制遗传体系,分析1a蛋白不同表达水平对基因组R3-gfp的影响。结果显示:瞬时表达载体pCB301在寄主植物中表达1a和2a蛋白能复制CMV基因组R3-gfp;在1a2aR3-gfp侵染本氏烟中RNA3和RNA4含量低于R1R2R3-gfp,1a2aR3-gfp复制的效率低于R1R2R3-gfp;在1a2aR3-gfp浸润接种的植物中,1a浓度接种提高,CMV基因组RNA3和RNA4复制受到抑制。该构建反式遗传复制体系为进一步研究CMV复制的分子机理提供实验材料以及理论依据。

MicroRNA靶向病毒携带的microRNA模拟靶序列对病毒的抑制作用

Micro RNA模拟靶序列(target mimic,TM)通过竞争性结合miRNA,从而干扰miRNA对靶标m RNA的调控.我们前期工作发现:以黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)作为载体在植物体内表达TM序列有效地抑制了miRNA的活性或稳定性,从而消减了miRNA对靶基因的调控.但是,miRNA与CMV携带的TM序列的结合在一定程度上抑制了病毒的积累.研究分析了miRNA靶向病毒携带的TM序列对病毒抑制作用的内在原因.a.通过RNA印迹分析CMV携带不同miRNA TM序列对病毒积累的影响,进一步明确miRNA靶向病毒携带的TM序列对病毒的抑制作用;b.利用GFP作为报告基因,通过荧光显微镜、蛋白质印迹以及RNA印迹分析TM序列对重组病毒积累的影响;c.以GFP作为报告基因,利用荧光显微镜观察和免疫印迹方法分析模拟靶序列对GFP翻译的影响;d.利用CMV病毒的反式复制系统分析miRNA模拟靶序列对病毒负链RNA合成的影响.结果表明,多种植物内源的miRNA靶向CMV基因组携带的miRNA TM序列,在不同程度上抑制了病毒的积累,miRNA与其TM序列的结合抑制GFP蛋白的翻译和负链的合成.植物内源的miRNA通过与病毒基因组携带的miRNA模拟靶序列结合,通过抑制病毒蛋白的翻译以及病毒负链RNA的合成,从而降低了病毒的积累水平.基于该论文的研究结果有可能建立一种抗病毒的新方法.

一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用

半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase,Cys P)是一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物多种生理过程。为了分析植物Cys P的特性,本实验首先通过RT-PCR技术从本氏烟中扩增获得了一个编码Cys P的基因(NbCys P)序列并连接至p EASYTM-T5 Zero载体,测序验证后亚克隆至原核表达载体p GEX-6P1,命名为p GEXNb Cys P;将其导入大肠埃希菌BL21plys S中诱导表达;重组表达的Nb Cys P融合蛋白经过亲和层析纯化,免疫兔子制备多克隆抗体,Western印迹分析显示,该抗体能和重组Nb Cys P蛋白发生强烈的免疫学反应且条带单一,表明所获得的Cys P抗体具有良好的特异性。上述结果为进一步鉴定植物Cys P的功能特性奠定了基础。

以黄瓜花叶病毒为载体表达绿色荧光蛋白

为了构建基于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的外源蛋白表达载体,实验在获得CMV的LS株系(CMV-LS)农杆菌侵染性克隆(pCB301-R1,R2和R3)的基础上,将CMV-LS基因组RNA3的外壳蛋白(coat protein,CP)基因置换成绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因,研究以CMV-LS为载体在本氏烟中表达GFP基因的情形。农杆菌浸润接种结果表明,以R1R2R3-gfp为载体在寄主中的GFP表达量远高于植物瞬时表达载体pCB301产生的GFP,番茄丛矮病毒基因沉默抑制子p19加入有助于CMV表达GFP,将移动蛋白(movement protein,MP)缺失C端的33个氨基酸残基而构建表达载体R1R2R3mpΔ33-gfp在寄主中的GFP含量大大增加。农杆菌菌液稀释接种的结果表明R1R2R3mpΔ33-gfp接种OD600值为0.01均能有效在本氏烟中表达产生GFP。

基于黄瓜花叶病毒基因组RNA2的外源基因表达载体研究

为了确定黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)基因组RNA2能否作为构建表达外源蛋白的载体,实验构建CMV的Fny株系(CMV-Fny)RNA2中2b基因缺失载体pCB301-F209Δ2b和携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因载体pCB301-F209Δ2b-gfp,并分别将含有质粒CMV-FnyΔ2b和CMVFnyΔ2b-gfp农杆菌混和物浸润接种寄主植物。结果表明:CMV-FnyΔ2b在本氏烟产生轻微花叶症状并且病毒基因组含量降低;在CMV-FnyΔ2b-gfp侵染植株叶片中有绿色荧光的产生;番茄丛矮病毒沉默抑制子p19加入有助于CMV-FnyΔ2b表达GFP;在RDR6含量减少的本氏烟RDR6i中,与对照接种植株相比,CMV-FnyΔ2b-gfp所产生的GFP增加。研究获得基于CMV基因组RNA2所构建的外源蛋白表达载体CMV-CMV-FnyΔ2b,并发现加入其它病毒基因沉默抑制子有利于GFP的表达。

基于烟草脆裂病毒构建同时表达2种外源蛋白的载体及其应用

目的构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料,缺失TRV RNA2的2b基因5’端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌豆早枯病毒(pea early-browning virus,PEBV)外壳蛋白(coat protein,cp)基因启动子,获得pTRV2e2载体;在pTRV2e2载体的2b和PEBV的cp启动子下游插入不同的外源基因,测定病毒TRVe2表达外源蛋白的能力、携带外源基因后重组病毒的稳定性以及分析蛋白质的生物学功能。结果病毒TRVe2能快速同时表达2个非融合的外源蛋白,且至少能表达70 ku外源蛋白,且该病毒携带~2.0 kb外源基因能稳定存活于寄主植物中;病毒TRVe2可用于分析蛋白质的生物学功能以及2个蛋白质间的相互作用。结论本文构建的重组病毒TRVe2为快速有效地表达2个外源蛋白以及分析2个蛋白质间的相互作用提供技术工具。

突变和重组可克服异源复制酶在病毒复制中的功能缺陷

异源复制酶的组合无法有效地支持重组病毒的复制是雀麦花叶病毒科病毒存在的普遍现象。利用雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属的典型成员黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和番茄不孕病毒(tomato aspermy virus,TAV)作为研究对象,分析2个复制酶的异源组合对重组病毒复制的影响。通过农杆菌浸润,将CMV RNA1(C1)和TAV RNA2(T2)进行异源组合,并将此与CMV RNA3(C3)或TAV RNA3(T3)混合侵染本生烟。接种后10 d,C1T2C3和C1T2T3接种的植物没有出现明显的病毒症状,通过Northern杂交,在系统叶中仅检测到微弱的病毒特异条带,这说明C1T2的异源组合无法高效地支持病毒的复制和侵染。当C1T2C3转接3代之后,接种的本氏烟植株表现明显的病毒症状,且病毒RNA的积累水平显著增加。病毒基因组RNA的测序结果显示,C1第1 390位、T2第1 695位发生点突变,而且C3的3'末端融合了T2的完整3'UTR序列。以上结果表明,通过病毒的突变或/和重组可有效提高异源复制酶对重组病毒的复制效率。

矮化突变番茄Micro Tom的快繁研究

对生命周期比一般番茄短的矮化突变体Micro Tom进行快繁研究。结果表明,子叶为愈伤组织、不定芽诱导的适宜外植体,MS+IAA 0.2 mg.L-1+6-BA 3 mg.L-1为适宜分化培养基,MS+IBA 0.1 mg.L-1+NAA 0.1 mg.L-1为适宜生根培养基,组培苗经过炼苗成活率可达95%。

稻瘟病菌几丁质结合蛋白MoChtbp1的功能初步研究

稻瘟病是一种由子囊真菌稻瘟病菌引起的危害粮食安全的世界性病害。多数效应蛋白对于稻瘟病菌的毒力起到重要作用,在与寄主植物的相互作用中至关重要,因此,筛选并鉴定稻瘟病菌效应蛋白,阐释其基因功能对于稻瘟病的防治具有重要意义。本研究根据已有的稻瘟病菌效应蛋白相关研究方法以及生物信息学软件筛选出了一个几丁质结合蛋白MoChtbp1,进一步利用叶鞘细胞—效应子分泌荧光表达观察体系确定MoChtbp1是一个质外体效应子。利用同源重组的方法敲除MoChtBP1,发现MoChtBP1的缺失不会影响稻瘟病菌在生长、产孢以及附着胞形成等方面的能力,但会导致其致病能力明显减弱。本文结果将为新的抗病水稻选种育种提供实验材料及理论依据。

TaSRT2 recognizes a viral protein to activate host immunity byincreasing histone acetylation

Histone acetylation is involved in chromatin structural remodeling and the regulation of gene expression, and it is important for the activation of defense-related gene expression in eukaryotes[1]. The silent information regulator 2(SIR2) family of proteins were initially described as nuclear proteins with histone deacetylase activity that causes chromatin compaction and gene silencing[2].