实验性大鼠脾气虚证模型的建立及指标检测

目的建立实验性大鼠脾气虚证模型,为相关中药药理学研究提供实验依据。方法采用劳倦伤脾加饮食失节多因素复合法建立中医脾气虚证大鼠模型,并通过体征变化、白细胞计数、淋巴细胞数量、红细胞计数和血红蛋白含量分析、胸腺指数和脾脏指数、D-木糖吸收实验等对所建模型进行评价。结果与对照组比,模型组脾气虚证大鼠体质量减少,毛色枯槁,泄泻;白细胞数、淋巴细胞数、血红蛋白含量、胸腺指数和脾脏指数较对照组均显著降低;脾气虚证大鼠的小肠吸收功能有所减弱。结论实验性脾气虚证模型建立成功,可用于相关中药的药理学研究。白细胞数和淋巴细胞数可作为判定脾气虚证动物模型的灵敏指标。

人八聚体结合蛋白4(Oct4)cDNA的克隆及其在大肠杆菌和HEK293T细胞的表达

目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体p ET-22b(+)-Oct4和真核表达载体pc DNA3.1(+)-his-Oct4。然后分别进行双酶切和测序鉴定。前者在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平。结果 PCR扩增得到约1100 bp目的 DNA片段;重组表达质粒p ET-22b(+)-Oct4和pc DNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;p ET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论Mr基本相符;pc DNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达。结论在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白。

基于UPLC/ESI-Q-TOF-MS技术的毛蕊异黄酮苷在大鼠血清中的代谢成分分析

目的研究毛蕊异黄酮苷在大鼠血清中的相关代谢产物。方法甲醇沉蛋白法进行样品前处理后,采用超高效液相-电喷雾-四级杆串联飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)在正离子模式下检测大鼠口服毛蕊异黄酮苷1h后血清中的相关代谢产物。结果共鉴定出了5个毛蕊异黄酮苷在大鼠体内相关代谢物,分别为葡萄糖醛酸化的毛蕊异黄酮苷(M2)、葡萄糖醛酸化的毛蕊异黄酮(M3)、毛蕊异黄酮(M4)和硫酸化的毛蕊异黄酮(M5和M6)。结论该方法对毛蕊异黄酮苷吸收入血的相关代谢成分进行了初步研究,为后续研究其在体内发挥药效的活性成分形式提供了实验基础。

蜜炙黄芪黄酮与皂苷有效部位的提取分离及对NO分泌水平的影响

目的建立高效、简便的方法对蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位进行分离,并探究二者对NO分泌水平的影响。方法采用Poly-Sery HLB固相萃取(Poly-Sery HLB SPE)法对蜜炙黄芪醇提物中的黄酮与皂苷部位进行分离,以UPLC/Q-TOF-MS对分离所得蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位进行定性定量分析。通过脂多糖体外诱导小鼠RAW264.7细胞建立炎症模型,采用MTT法检测蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位的细胞毒性作用,采用Griess法检测蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位作用后炎症细胞内NO的表达水平。结果 Poly-Sery HLB SPE能很好地富集与分离蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位,使得二者相对质量分数达到96.59%、95.06%。蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位对RAW264.7细胞NO分泌释放均具有显著的抑制作用,炎症模型组的NO释放量为5.28μmol/L,蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位给药组的NO释放量分别为2.31μmol/L与2.01μmol/L。结论 Poly-Sery HLB SPE法能高效分离蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位;蜜炙黄芪黄酮和皂苷部位均能有效抑制炎症模型细胞NO的释放,推测具有抗感染免疫活性。

基于UPLC/Q-TOF-MS技术的大鼠尿液中蜜炙黄芪三种主要活性成分含量测定方法的建立

目的建立大鼠尿液中蜜炙黄芪三种活性成分毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪甲苷的含量测定方法。方法采用Phenomenex kinetex柱为色谱柱,0.2%乙酸水-乙腈为流动相梯度洗脱,柱温2 5℃,流速0.3 ml/min,在负离子模式下采用UPLC/Q-TOF-MS技术对大鼠尿液中毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪甲苷的含量进行测定。结果毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪甲苷分别在6.42 min,10.48 min和11.14 min左右出峰,表明三个物质在色谱柱上分离度良好;其分子离子峰分别为m/z 283.06[M-H]^-,m/z 267.06[M-H]^-和m/z 843.47[M+CH_3COO]^-,选择性强。毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪甲苷分别在1.55~250μg/ml,0.234~50.0μg/ml和0.100~12.8μg/ml范围内线性良好;在不同浓度内,此法的日内、日间精密度和准确度均小于±15%,相对回收率均大于80%,基质效应的RSD值均小于15%。结论 UPLC/QTOF-MS技术可用于蜜炙黄芪的体内含量测定,且符合生物样品分析要求,灵敏度高,重复性好,是一种快速可靠的新方法。