双表达载体研究GM-CSF对HCVC基因免疫应答的影响

目的 HCV C蛋白基因诱导的免疫应答较弱 ,因而增强 HCV C蛋白基因免疫对于开发 HCV疫苗具有极其的重要性。方法将 GM- CSF基因与 pc15 4基因插入双表达载体 pc DNA3 .0 BA构建成双价质粒 pc DNA3 .0 BApc15 4 GM- CSF,肌肉免疫 Balb/ c小鼠。结果 GM- CSF和 pc15 4在 Cos- 7细胞中同时获得瞬时表达 ;pc DNA3 .0 BApc15 4 GM- CSF双价质粒较单价 pc DNA3 .0 BApc15 4诱导小鼠产生抗体的几何平均滴度显著增高 ( P=0 .0 4 ) ,而 pc DNA3 .0 BApc15 4 + pc DNA3 .0BAGMCSF混合质粒较单价质粒 pc DNA3 .0 BApc15 4诱导小鼠产生抗体的滴度极显著降低 ( P<0 .0 1)。HCV C蛋白抗原特异性的脾淋巴细胞增殖能力 ,双价质粒较单价及单价混合质粒极显著增高 ( P<0 .0 1)。结论双表达载体同时输送 GM- CSF与pc15 4基因能增强 Balb/ c小鼠对 HCV C蛋白基因的体液免疫应答及免疫鼠脾淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力。

应用二倍体细胞培养脊髓灰质炎病毒适宜条件的研究

目的 为用KMB17细胞制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗提供适宜条件。方法 检测不同培养液、不同代次、不同细胞龄和不同病毒感染量等因素对病毒滴度及产量的影响。结果 细胞对脊髓灰质炎病毒的敏感性随细胞龄的增加而降低，培养后24、48、72和96h单个细胞中脊髓灰质炎病毒产量分别为986、745、594和237 Lo-．gTCID50；细胞感染脊髓灰质炎病毒后出现细胞病变时间跨度大于48h，早期从病变细胞释放出的病毒在培养上清中不稳定，感染性滴度每24h降低0．25 LogTCID50以上。结论 KMB17细胞培养脊髓灰质炎病毒的感染性滴度和产毒量受培养液营养成分和病毒接种时细胞龄等条件的影响。

脊髓灰质炎病毒Sabin株工作种子批基因鉴别

目的研究脊髓灰质炎病毒Sabin株基因鉴别的方法。方法分别进行脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ型Sabin株和Ⅲ型Pfizer株3个型的工作种子批病毒RT-PCR,对扩增产物进行SDS-PAGE及测序。结果Ⅰ、Ⅱ型Sabin株和Ⅲ型Pfizer株3个型的工作种子批病毒分别出现了97、71和53bp的电泳带,与预期结果相符。扩增基因序列与报道的脊髓灰质炎病毒减毒株序列一致。结论RT-PCR可以用于脊髓灰质炎病毒Sabin株毒株鉴别。

猕猴自然感染肝片吸虫诱发胆管结石的形成

在研究肝片吸虫诱发猕猴自发性胆结石形成的病理学基础上 ,采用红外光谱分析、原子吸收光谱分析和组织化学染色对胆结石的成分及结构进行了测定 ,初步探讨了本病发生的机理。在一只 9岁雌性猕猴肝总胆管内发现 4条肝片吸虫 (Fasciolahepatica) ,胆囊胆汁中检出大量肝片吸虫虫卵。左侧胆管内有一颗棕黑色结石 ,直径为 1cm、长约 2 5cm圆柱形。肝细胞灶性坏死伴有轻度结缔组织增生 ,胆管腺体重度增生 ,上皮细胞胞质内含有中性与酸性混合型粘多糖物质 ,上皮间有大量杯状细胞。胆石切面呈环状 ,环层间含有粘多糖物质。胆石经红外光谱分析出现胆固醇 -胆色素混合型胆石和黑色物质特征性吸收峰 ;

脊髓灰质炎减毒活疫苗的高效纯化及特性研究

应用Q SepharoseFastFlow对Vero细胞基质制备的I型口服脊髓灰质炎减毒活疫苗悬液进行纯化。病毒液经滤过澄清和超滤浓缩 ,获得 85%的病毒感染性滴度回收率 ,而经Q SepharoseF .F .纯化的病毒悬液 ,病毒感染性滴度回收率达 10 0 %。纯化后的病毒液用α 32 PdATP标记DNA探针膜杂交法测定 ,宿主Vero细胞基质DNA残余含量远低于 10 0 pg/剂量的标准 ;rct/ 4 0特征、病毒形态及病毒衣壳蛋白组份等生物学性状无显著变化。研究结果提示 ,Q SepharoseF .F .是Vero细胞制备口服脊髓灰质炎减毒疫苗的理想纯化材料。

膜结合表达对HCV C基因免疫的影响

目的探讨膜结合表达对基因免疫的影响。方法流感病毒跨膜蛋白基因修饰带 HBV pre C分泌型信号肽的HCV C6 9基因 ,构建 pc6 9TM质粒 ;35S-甲硫氨酸代谢标记和免疫沉淀检测质粒体外瞬时表达蛋白 ;肌肉免疫 Balb/c小鼠。结果 pc6 9TM基因表达出的蛋白存在于膜上。免疫鼠淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力 pc6 9TM较分泌表达型质粒pc6 9显著增强 (P=0 .0 3) ,而 2种质粒诱导小鼠产生抗体效价差异不显著 (P=0 .76 5 )。结论膜结合表达能增强 HCV C6

基因免疫机理及安全性研究进展

基因免疫被誉为疫苗学上的一场革命 ,本文就基因免疫的机理。

基因疫苗生物学特征及影响其免疫应答的因素

基因免疫有其独有的生物学性质 ,本文就基因免疫的生物学特性和影响基因免疫应答的因素进行了概述 ,以便深入研究基因免疫。

Vero、CHO和杂交瘤细胞在生物反应器中的生长和代谢

目的 研究Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ和杂交瘤细胞在生物反应器中的生长和代谢。方法 应用搅拌式生物反应 器，培养了Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ和鼠杂交瘤７Ｈ３细胞，对营养物质及代谢产物进行定量分析．测定各个培养中发酵相关参数。 结果 培养过程中葡萄糖和谷氨酰胺的摄取与培养液中两者的浓度正相关。控制营养物质的加入可提高细胞产 量。结论Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ和７Ｈ３细胞在生物反应器培养中有相同的生长和代谢模式。

流感病毒在Vero细胞上的适应性

目的研究WHO指定流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上的适应性,为用Vero细胞制备流感疫苗奠定基础。方法优化不同培养基、胰酶浓度、pH值等培养病毒的条件及收毒时间,将流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,并进行血凝效价检测及RT-PCR分析。结果在病毒维持液为F12+DMEM、pH为7.5、胰酶含量为1.5μg/ml、培养3 d收获病毒时,可获得较高的病毒血凝效价,连续传4代,病毒血凝效价降为0,RT-PCR检测结果为阴性。结论WHO推荐的流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,病毒血凝效价逐渐降低。

流感病毒在不同细胞中适宜培养条件的研究

目的探索流感病毒在细胞中培养的适宜条件。方法采用MEK细胞、FRhK-4细胞、MDCK细胞分别接种甲型流感病毒H1N1型、H3N2型和乙型流感病毒疫苗毒株,观察3种毒株在不同培养条件下的细胞病变、血凝滴度。结果3株流感病毒接种细胞在33℃培养72h后出现拉网、圆缩、脱落等现象;FRhK-4细胞和MDCK细胞对流感病毒较敏感。胞龄为48h的细胞,在NaHCO3的终浓度为1.4‰,TPCK-胰酶浓度为1.0μg/ml的病毒维持液培养流感病毒为最适条件。结论寻找到了细胞流感病毒的适宜条件。

HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性研究

目的研究 HCV核心蛋白在大肠杆菌中的非融合表达及重组蛋白的免疫学特性。方法用 DNA重组技术在两种表达质粒 (p QE3O和 p Trc His A)、4种宿主菌 (DH5 a,TOP10 ,BL2 1和 M15 )中表达 HCV全长及羧基端部分缺失的核心蛋白 (aa1～ 191,aa1～ 15 4和 aa1～ 6 9) ,表达蛋白经 SDS- PAGE检测 ,免疫印迹分析 ,亲和层析法纯化后免疫 BAL B/C小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠血清中抗 HCV抗体水平。结果 HCV核心蛋白 C15 4,C191在 p QE30 /M15中获得了表达 ,表达量分别占菌体总蛋白的 18.2 %和 9.3%。免疫印迹分析的结果显示在 C15 4和 C191相应位置处出现杂交条带。 EL ISA结果显示C15 4和 C191诱导小鼠产生了抗 HCV抗体。结论表达的重组蛋白具有抗原特异性和免疫原性。“截断”型

狂犬病毒aG株糖蛋白在CHO细胞中的表达

目的克隆狂犬病毒aG株糖蛋白(Glycoprotein)基因,构建重组真核表达载体,在CHO细胞中表达aG株糖蛋白。方法采用RTPCR,从狂犬病毒aG株基因组RNA中扩增GP基因,并将该基因克隆至真核表达载体pCIdhfr上,以脂质体介导法转染CHOdhfr-细胞。用MTX筛选的抗性克隆经ELISA、免疫荧光及Westernblot检测GP蛋白的表达。结果克隆到狂犬病毒aG株糖蛋白全长基因,并在CHO细胞中进行表达。结论成功地在CHO细胞中表达了狂犬病毒aG株的糖蛋白,为进一步开发狂犬病毒基因工程疫苗打下基础。

二乙烯亚胺灭活流感病毒的效果观察

目的观察二乙烯亚胺(BEI)对流感病毒的灭活效果。方法分别使用甲醛和BEI对流感病毒进行灭活试验,通过血凝试验检测二者灭活效果,并确定各自最佳灭活时间。用灭活的病毒液免疫小鼠,检测其抗原性,并用RT-PCR方法分析灭活病毒基因组的完整性。以裂解剂TritonX-100裂解病毒后,分别加入甲醛和BEI灭活,采用单向免疫扩散法检测灭活不同时间病毒液的HA含量。结果BEI灭活36h可将病毒完全灭活;BEI灭活的病毒免疫小鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体;BEI灭活病毒液经RT-PCR,不能扩增出病毒基因;BEI灭活病毒的HA平均含量比甲醛灭活病毒的HA平均含量略高。结论BEI在灭活流感病毒感染性的同时,能够灭活病毒基因,并较好地保持病毒的抗原性。

应用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒

目的 研究用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒W株的可行性。方法 Vero细胞悬浮吸附HAVW株后 ,接种到搅拌式生物反应器中 ,用微载体进行培养 ,对营养物质、代谢产物及病毒的增殖进行分析。结果 经四周的培养 ,病毒收获时 ,细胞密度达 1.4× 10 6 ml,甲肝病毒抗原滴度达 1∶64。结论 W株已适应于Vero细胞中 ,用生物反应器培养产毒 。

生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒

目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数最高;病毒培养体积达350L,病毒收获液滴度大于7.625lgCCID50∕ml。结论通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒。

PEG-6000纯化流感病毒鸡胚尿囊液的研究

目的探讨PEG沉淀法纯化鸡胚培养流感病毒尿囊液的工艺,对PEG-6000的浓度、沉淀时间、离心力进行优化,为流感病毒抗原和抗体制备提供了便捷的手段。方法向流感病毒鸡胚尿囊液添加PEG后进行高速离心收集沉淀,检测纯化病毒液效价、病毒形态,以及卵清蛋白含量。结果 PEG浓度为4%,沉淀时间2h,离心力8 000g条件下,病毒能完全沉淀,杂蛋白卵清蛋白含量低,病毒颗粒完整,浓缩液中病毒血凝效价为1∶10 240。以纯化病毒免疫山羊3次后,血清抗体滴度为1∶1 024且无交叉。结论本研究初步证明优化后的PEG沉淀法对鸡胚培养流感病毒尿囊液中的病毒浓缩、纯化达到了很好的效果。

乙型与丙型肝炎病毒DNA疫苗研究概况

基因疫苗不仅能诱导宿主CD4^+T细胞介导的体液免疫应答,而且在机体内表达的蛋白还能诱导CD8^+细胞介导的细胞免疫应答,给乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)治疗和预防性疫苗的研制带来了新希望。本文综述了近年有关HBV和HCV DNA疫苗的研究进展。

流感病毒裂解疫苗儿童剂型在小鼠中的安全性及免疫原性研究

目的比较本研究所制备的流感病毒裂解疫苗儿童剂型(昆明疫苗)与赛诺菲巴斯德流感裂解疫苗儿童剂型(巴斯德疫苗)在动物中的安全性和免疫效果。方法用流感病毒裂解疫苗儿童剂型于0d和14d,腹腔内接种ICR小鼠。每天称取体质量,免疫后35d,眼眶采血分离血清,用微量血凝抑制(HI)法测定小鼠血清中特异性抗体滴度,计算抗体阳转率、保护率及几何平均滴度(GMT)增长倍数。结果免疫后小鼠体质量逐渐增加,组间无明显差异;两组间HI抗体阳转率、保护率及H1N1、H3N2型和B型HI抗体倍数差异无显著意义。结论两种疫苗均具有很好的安全性和免疫原性。