小鼠髓源未成熟树突状细胞的分离与培养

本试验旨在建立一种体外诱导培养小鼠未成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法。应用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)在体外诱导小鼠骨髓前体细胞分化为未成熟树突状细胞,进行形态学观察、细胞表型分析、刺激T细胞增殖等方法,对小鼠髓源未成熟树突状细胞的体外诱导培养进行鉴定。试验结果显示,小鼠骨髓来源的DC在体外培养8d后,特异性细胞表面标志CD11c的表达量达到81.09%,中度表达MHCⅡ,低表达CD40、CD80、CD86。本试验成功地建立了体外小鼠髓源DC扩增的方法。

贝氏柯克斯体精氨酸受体基因的原核表达及免疫原性分析

构建贝氏柯克斯体精氨酸受体(argR)的重组表达载体并分析该重组蛋白的免疫原性。应用PCR方法,以贝氏柯克斯体九里株为模板,扩增出含734bp的精氨酸受体目的基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,得到重组表达质粒pGEX-6p/argR,经IPTG诱导表达后产生ArgR重组蛋白,SDSPAGE分析该蛋白大小约为25ku,Western blot结果显示,表达的重组蛋白有着良好的免疫原性。用argR免疫小鼠,能诱发特异性抗体的产生,说明该原核表达蛋白具有良好的免疫原性。

肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断

采用多种诊断方法,对2008年以来湖北省多个地区新引进育肥肉牛呼吸道传染病进行了病原学研究。患牛病理变化主要集中在肺部,轻者可见肺局部肉样变,严重者可见肺广泛分布干酪样或化脓性坏死灶。将肺坏死组织制作石蜡切片,显微镜观察发现,肺组织表现为坏死性肺炎,未见典型的结核结节。实验室病原检测项目包括:支原体培养鉴定,PCR检测与目的基因测序鉴定;细菌分离鉴定;牛结核检测;泰勒虫血涂片检测与PCR检测等。最终确定该新发呼吸道传染病为牛支原体(Mycoplasma bovis)肺炎。同时,环形泰勒虫混合感染与细菌继发感染率很高,使病情复杂化。通过药敏试验发现,不同牛场分离的牛支原体最敏感药物为环丙沙星,其次为左氟沙星、四环素。文中还对该病的综合防治提供了合理的建议。

梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达。表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104U/mL和4.61×104U/mL。结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。

Q热贝氏柯克斯体间接ELISA检测方法的建立

本研究以Q热贝氏柯克斯体弱毒株Ⅱ相全菌为包被抗原建立Q热贝氏柯克斯体间接ELISA检测方法,通过方阵滴定法对抗原包被浓度和二抗反应浓度的确定及各项反应条件的优化,确定其阴阳性临界值为0.44。用本方法与IDEXX Q热抗体检测试剂盒对393份牛临床血清进行检测,检出的血清阳性率分别为11.45%和6.10%,符合率为94.66%。结果表明,本试验建立的检测Q热贝氏柯克斯体的间接ELISA法具有较好的特异性及较强的敏感性,可初步应用于Q热贝氏柯克斯体抗体的临床检测。

奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法的建立及应用

奶牛白细胞黏附缺陷症(bovine leukocyte adhesion deficiency,BLAD)是一种常染色体隐性、致死性、遗传性疾病,严重影响奶牛生产性能和奶牛场的经济效益。为建立快速可靠的BLAD检测方法,本试验根据GenBank中BLAD CD18序列设计引物,PCR扩增后纯化产物,构建A/A、A/G和G/G 3种基因型标准质粒。用标准质粒建立焦磷酸测序检测方法。用建立的方法检测奶牛血液样品,其结果与Sanger测序结果进行比较,分析和验证检测结果的准确性。用建立的方法对300份奶牛血液样品进行检测,结果显示样品中A/A基因型检出294例,占总体比例的98%;A/G基因型检出6例,占总体比例的2%。随机抽取30份已检测样品进行Sanger测序,结果显示与焦磷酸测序法结果一致。本试验结果表明焦磷酸测序法检测BLAD,具有特异、灵敏、快速的特点,其检测结果准确可靠,适合于试剂盒的研发及应用于BLAD的临床诊断。

融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

Q热贝氏柯克斯体环介导等温扩增实时浊度检测法的建立

根据Q热贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)插入序列IS1111序列设计1套特异性引物,建立快速检测Q热的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)实时浊度检测方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,在恒温反应条件下,对靶基因的特定区域进行扩增,建立LAMP检测方法。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒,而对结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏杆菌(Brucella.spp)及部分牛血液的核酸样本的特异性检测结果均为阴性,无交叉反应。本研究建立的LAMP实时浊度检测方法灵敏度高、特异性好,在Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。

Q热贝纳柯克斯体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入序列IS1111序列设计引物,建立快速检测Q热的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能检测出102个拷贝数的阳性质粒。标准曲线相关系数为0.991,扩增效率为98%。对结核分支杆菌、衣原体、布鲁氏杆菌及牛血液的核酸样品的特异性检测结果均为阴性。结果表明本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法灵敏度高且特异性好,可用于临床检测。

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。

基于子午流注理论的择时五音疗法配合穴位贴敷对更年期抑郁症的影响

目的:探究基于子午流注理论的择时五音疗法配合穴位贴敷对更年期抑郁症的影响。方法:选取2021年6月-2022年7月赣州市第三人民医院收治的86例女性更年期抑郁症患者,按随机数字表法分为两组,各43例。在常规西药治疗基础上,对照组采取常规护理,观察组在对照组基础上采取基于子午流注理论的择时五音疗法与穴位贴敷干预。比较两组干预前、干预8周后的抑郁程度[汉密尔顿抑郁量表(HAMD)]、睡眠质量[匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)]、雌激素水平[黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)]、生活质量[健康状况调查简表(SF-36)]。结果:干预8周后,两组HAMD评分、PSQI评分均较干预前降低,且观察组均较对照组低,SF-36各维度评分均较干预前升高,且观察组较对照组高(P<0.05)。两组干预8周后的FSH、LH均较干预前降低,观察组均较对照组低,两组E2均较干预前升高,观察组较对照组高(P<0.05)。结论:基于子午流注理论的择时五音疗法与穴位贴敷干预可缓解更年期抑郁症患者的抑郁程度,改善雌激素水平,提高其睡眠质量及生活质量。

布鲁菌OMP28蛋白的原核表达与间接ELISA方法的建立

对布鲁菌Omp28基因进行大肠埃希菌表达,用表达的布鲁菌重组蛋白Omp28作为抗原包被酶标板,建立检测布鲁菌抗体间接ELISA方法,进一步研发试剂盒,用该试剂盒和IDEXX抗体检测试剂盒同时对540份临床牛血清样品进行检测,评价二者的符合率。反应条件优化后,该试剂盒的抗原包被浓度为1μg/mL,作用条件为37℃1h;封闭液为50g/L脱脂乳,作用时间为30min;血清稀释度为1∶200,作用时间为30min;酶标二抗稀释度为1∶3×104,作用时间为30min;与IDEXX抗体检测试剂盒的符合率达96.67%,证明该试剂盒可用于临床牛布鲁菌抗体的检测。

贝氏柯克斯体外膜蛋白H(OmpH)原核表达载体的构建与鉴定

本试验旨在构建贝氏柯克斯体外膜蛋白H(outer membrance protein H,OmpH)的重组表达载体并分析该蛋白的免疫原性,以贝氏柯克斯体九里株为模板,通过PCR方法扩增出含798bp的贝氏柯克斯体的OmpH基因片段,并将其克隆至原核表达载体pQE-30,得到重组表达质粒pQE-30/OmpH。经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果发现,该重组蛋白大小约为25ku。Western blotting试验结果显示,该方法所诱导产生的重组蛋白具有良好反应原性。

新课程理念下中学体育合作学习评价方式的研究

在中学体育教学中，合作学习评价仍然是一种全新的评定方式，并在各个中学的体育教学中得到了广泛的运用，它以技能合作学习为前提，激发学生的集体荣誉感，从而充分的调动学生的积极性来进行合作学习，同时体育合作学习的评价标准也得到了相应的提高，使学生主动、自觉的参与到学习中，并最终实现良好的体育教学目标。本文通过对合作学习评价的内涵和特征进行分析，并进一步的指出在合作学习评价在中学体育教学中的具体操作方式。

荧光定量检测评估规模化猪场环境中PEDV病毒载量

试验选择某腹泻暴发场(母猪规模13 000头),通过检测门卫室、转猪车轮胎、水源、产床、鞋底等区域棉拭子中PEDV载量,查找到猪场生物安全上容易存在的漏洞(产房消毒不彻底、鞋底携带病毒、转猪车轮胎消毒不彻底、工作人员窜场导致感染范围扩大、工作人员清洗体表不彻底等),通过荧光定量全面评估猪场环境中PEDV载量,查找生物安全漏洞,建立健全的生物安全体系的评估机制。结果表明,经过1个月的整改,最终该猪场环境中PEDV载量急剧下降,阳性率由整改前的100%(8/8)降低为整改后的21.43%(3/14),从而帮助该猪场降低环境PEDV载毒量,并建立完善的PEDV防控的生物安全体系。

教学模式在中学体育中的运用与研究

随着课程改革的推进，体育课程也被纳入到课程改革要求之中，为了让学生在负担繁重的学习任务时拥有一个健康良好的体魄，加强体育教学质量就变得尤为重要。合作学习作为教学改革提出的新型体育教学方法，它是建立在其它学科成功的教学经验基础上，在增强学生身体素质的同时，最大程度的提高学习效果。本文通过分析合作学习教学模式在中学体育中的发展现状，针对该教学模式在中学体育教学中出现的问题进行研究，并分别从课堂管理、课堂引导、教学方法和学习时间等几方面进行调整和改善，促进合作学习在中学体育教学中的运用。

奶牛白细胞黏附缺陷症HRM检测方法的建立及应用

根据GenBank中奶牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)CD18序列设计引物,进行PCR扩增后纯化产物,构建A/A型、A/G型和G/G型3种标准质粒,用标准质粒建立HRM检测方法。用建立的方法对300份奶牛血液样品进行检测,将其结果与Sanger测序结果进行对比,分析和验证检测结果的准确性。结果显示,样品中A/A基因型检出294例,占总体的98%;A/G基因型检出6例,占总体的2%,且两种检测方法的结果一致。结果表明,HRM检测BLAD具有简便快速、特异和灵敏等优点,可作为BLAD携带者突变筛查的优选方法。