增加革兰阴性菌外膜囊泡产量的研究进展

外膜囊泡(OMVs)是由革兰阴性菌释放的一种囊泡状结构,在革兰阴性菌的生长、感染以及与周围环境交流等过程中发挥重要作用。由于OMVs无活性、不能复制且具有良好的免疫原性,被广泛应用于新型疫苗的研究。但天然OMVs产量低,无法达到规模化生产的要求,OMVs产量提升是OMVs疫苗产业化要解决的关键核心技术问题。本文主要从细菌基因改造、生长培养条件优化和OMVs生产纯化工艺优化3个方面对提升OMVs产量的研究进行综述,以期为OMVs疫苗产业化研究开发提供参考。

湖北1型鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定

湖北地区某鸭场20日龄樱桃谷鸭发生疑似鸭疫里默氏杆菌病,临床表现为缩脖、腿发软,部分病鸭表现为仰卧、双腿划动呈游泳状,临死前出现典型的神经症状。剖检病变呈典型的心包炎、肝周炎和气囊炎。用含5%小牛血清的TSA平板从病鸭中分离到8株细菌,经过染色、PCR及测序分析、玻片凝集和动物回归试验,综合分析鉴定为1型鸭疫里默氏杆菌。

鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

对武汉周边地区发病鸭场的病死鸭进行了病理剖检,直接从病死鸭肝脏、心血及脑组织中进行细菌分离培养,通过培养特性、生化鉴定、动物回归试验确定为鸭疫里默氏杆菌感染。分离到8株鸭疫里默氏杆菌,对分离株进行了药敏试验,结果表明分离株对头孢唑啉钠、先锋V、丁胺卡那霉素、新霉素、氨苄青霉素的敏感性较高。

PCR在鸭瘟临床诊断和免疫及致病机理研究中的初步应用

根据GenBank文献,应用Oligo6 0分析软件合成了用于扩增鸭瘟病毒(duckplaguevirus,DPV)EcoRⅠ765bp片段的1对引物,上游引物(P1)位于EcoRⅠ片段的246～266nt,下游引物(P2)位于EcoRⅠ片段的727～744nt,以DPVCHa株DNA为模板,筛选PCR最佳反应条件,建立了检测DPV的PCR方法。应用该方法对强毒株DPV鸭胚培养物和弱毒株的鸡胚培养物进行扩增,均可获得498bp的DNA片段。而对正常鸭(鸡)胚和鸡马立克氏病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鸭副伤寒沙门氏菌和鸭疫里默氏杆菌培养物进行检测,结果均呈阳性。扩增产物测序结果与文献报道一致,证明了PCR方法的特异性。对DPVCHa株鸡胚毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为10fg。用病毒分离、Dot-ELISA和PCR三种方法分别检测1990～2002年期间送检的临床样品,对所获得的结果进行χ2分析,证明PCR检出率明显高于前2种方法。CHa株免疫雏鸭后对血液、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌头、肌肉、骨髓、食道共18种组织和粪便进行PCR检测,结果表明:①皮下接种4h后,心、肝、脾、肾、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑和小脑为阳性,8h后18种组织和粪便均为阳性;②口服接种4h后舌头和食道为阳性,8h后,

鸭瘟病毒弱毒株在免疫雏鸭体内的分布和排毒规律

鸭瘟病毒(DPV)弱毒Cha株经皮下、口服和滴鼻3种途径免疫1日龄雏鸭,应用聚合酶链反应(PCR)检测了病毒在体内分布和排毒规律。Cha株免疫雏鸭后,对血液、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌、肌肉、骨髓、粪便和食道共19种组织PCR检测结果如下(1)皮下接种雏鸭后4h,即可在心、肝、脾、肾、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑和小脑共10种组织中检出DPV的DNA;8h后,所有采取的组织器官均可检测到DPV的DNA。(2)口服接种雏鸭后4h,可在舌和食道中检测到DPV的DNA;8h后,可在心、肝、脾、肾、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌、食道和血液共12种组织器官中检出DPV的DNA。(3)滴鼻接种雏鸭后4h,未能在各种组织中检出DPV的DNA;8h后,可在心、肝、脾、肾、胸腺、延脑、大脑、小脑、舌、食道和血液共11种组织中检测到DPV的DNA。(4)在3种免疫途径中,检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏、脑(大脑、小脑和延脑);3种途径免疫的鸭,从免疫后12h至21d均能从所有采集的组织中检测出DPVDNA。

鸭病毒性肠炎病毒强毒株的形态发生学与超微病理学研究

应用透射电镜和超薄切片技术,研究鸭病毒性肠炎病毒(duckenteritisvirus,DEV)CH强毒株人工感染成年鸭后,病毒在宿主细胞内的形态发生及各组织器官的超微结构变化。结果表明,感染后不同时间剖杀及发病后死亡鸭的肝、肠、脾、胸腺、法氏囊等组织器官中,均观察到典型的疱疹病毒粒子。病毒主要的靶细胞为淋巴细胞、网状内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、肠道上皮细胞、肠道平滑肌细胞和肝细胞等。DEV的核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型四种形态,存在胞核和胞浆两种装配方式。病毒核衣壳可在核内获得皮层,通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒;也可通过内外核膜进入胞浆,在其中获得皮层,然后在各种质膜上获得囊膜,最后成熟病毒释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密病毒核酸颗粒、微管和中空短管以及胞浆内膜包裹的电子致密小体、双层管等病毒相关结构。超微研究表明,组织细胞有坏死和凋亡两种变化。坏死细胞肿胀甚至破裂,线粒体肿胀空泡化,粗面内质网扩张,核糖体脱落,有的细胞器甚至完全崩解,染色质或固缩或溶解。凋亡细胞则染色质聚集,胞浆凝聚深染,细胞膜上有大量空泡,并有凋亡小体形成。细胞坏死与凋亡往往同时存在,疾病发?

鸭瘟病毒强毒株在急性人工感染成年鸭病例体内分布规律

5 6只 3月龄四川麻鸭经皮下接种鸭瘟病毒 (DPV)强毒 SC1株 ,成功建立了 DPV感染的急性病理模型 ,并应用PCR方法检测了不同时间 DPV在感染鸭体各组织器官的分布情况。结果表明 ,接种 2 h后 ,即能够从脑、肝、脾、法氏囊、胸腺中检出 DPV DNA;12 h,可从心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、脑、胸肌、食管、腺胃、血液、舌、口腔分泌物、皮肤、骨髓和粪便等检测到 DPV的 DNA。检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏和脑组织。本试验为阐明 DPV的致病机理和应用 PCR方法检测感染鸭体组织中的 DPV提供了重要的实验数据。

鸭病毒性肠炎病毒强毒在人工感染鸭体内形态结构和发生学的电镜观察

为研究鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CH强毒株在感染鸭体内的分布和形态学发生规律,应用透射电镜和超薄切片技术对人工感染DEV的成年鸭各组织器官进行观察。结果表明:感染后12 h在脾脏和法氏囊首先观察到少量的DEV出现,24 h后在脾、胸腺和法氏囊以及死亡鸭的肝、肠和胰中均观察到具有典型的疱疹病毒粒子及其核衣壳形态的DEV。DEV病毒核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型4 种形态,存在胞核和胞浆两种装配方式。病毒成熟有两种方式:一为细胞核内核衣壳在核内获得皮层,通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒;二为核内核衣壳通过内外核膜进入胞浆,核内和胞浆内的核衣壳在细胞浆中获得皮层,然后在各种质膜上获得囊膜,最后成熟病毒通过细胞破裂或其他方式释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密颗粒、核内微管和中空短管、胞浆电子致密小体等结构。

一种新发现的鸭病毒性肿头出血症的研究

对 1998年以来在四川省、重庆市、贵州省和云南省等养鸭省份发生的一种以鸭头肿胀、眼结膜充血出血、全身皮肤广泛性出血、肝肿胀呈土黄色并伴有出血斑点、体温 4 3℃以上、排草绿色稀粪等为特征的急性传染病进行了流行病学调查、临床症状和病理变化观察、病理组织学检查、病原分离鉴定、人工感染试验、电镜观察、防治试验 ,确诊为一种新病 ,暂时将其命名为“鸭病毒性肿头出血症 (Duckviralswollenheadhaemorrhagicdisease)”。用鸭胚原代成纤维细胞自不同地区病死鸭分离到 12株抗原性一致的病毒 ,病毒粒子呈球形或椭圆形 ,直径约 80nm ,无囊膜 ,核酸为RNA ,不凝集鸡、鸭、鹅、鸽、黄牛、水牛及猪的红细胞 ,在 pH 4 .0～ 8.0稳定 ,对氯仿有抵抗力 ,与鸭瘟病毒和鸭病毒性肝炎病毒无抗原相关性 ,琼脂扩散试验证实与番鸭细小病毒、禽流感病毒、鸡传染性腔上囊病病毒、禽病毒性关节炎病毒和鹅副黏病毒无抗原相关性。分离毒经口服、皮下注射、肌肉注射和滴鼻途径感染鸭均能成功复制出与临床病例一致的症状和病变 ,而不能感染SPF鸡(鸡胚 )和鹅。制备的超免疫血清和康复鸭血清具有良好紧急预防和治疗效果 ,利用病死鸭内脏制备的组织灭活疫苗和分离毒制备的油剂灭活疫苗具有良好预防效果。根据分离病毒特性建议?

检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立

【目的】建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒(DEV)核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎(DVE)存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段。【方法】据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测。【结果】间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌病和鸭大肠杆菌病死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对人工感染DEV后2、4、6、12、24、48和72 h不同时间的鸭肝脏检测结果均为阳性,阳性细胞有肝细胞、窦皮细胞和枯否氏细胞,阳性信号多出现于坏死细胞的碎片中或细胞坏死后形成的空泡内及空泡边缘;对存档蜡块、临床病料的检测与病毒分离鉴定吻合率为100%。【结论】本研究建立的间接原位PCR方法具有直观、敏感、特异性强的优点,在显示核酸阳性信号的同时,还能判别含有靶序列的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。可用于DVE的诊断、分子流行病学调查、存档蜡块的回顾性诊断和致病机理的研究。

用间接免疫荧光染色法检测鸭病毒性肠炎病毒在人工感染鸭体内的侵染过程和分布规律

用鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CHv强毒株感染成年鸭复制鸭病毒性肠炎急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、食道、十二指肠、胰腺、法氏囊和脑组织,制作切片,应用间接免疫荧光染色法(IFA)检测DEV在鸭体内的侵染过程和分布规律。结果显示:感染后4 h可在脾脏、胸腺和法氏囊中检测到DEV抗原;感染后6 h可在肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏检测到DEV抗原;IFA对各组织器官中DEV的平均检出率为肝脏46/50、脾脏48/50、肺脏46/50、肾脏0/50、肠道46/50、法氏囊46/50、胸腺47/50、胰腺0/50、大脑0/50、食道44/50、心脏0/50。研究表明:在急性病例中,脾脏、法氏囊、胸腺、食道、肠道、肝脏和肺脏为DEV的主要靶器官;接种后,病毒首先在脾脏、胸腺、法氏囊中出现,然后病毒迅速传播到肝脏、消化道和肺脏中;IFA检测石蜡切片中DEV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的较好方法。

间接酶免疫组化检测DPV在感染鸭体内细胞定位的研究和应用

以超速离心浓缩结合蔗糖密度梯度离心法提纯的鸭瘟病毒(DPV)作为抗原免疫家兔制备兔抗DPV血清,用饱和硫酸铵沉淀结合DEAE-Sephedax-A-50离子交换柱层析提纯兔抗DPV IgG,建立了检测甲醛固定鸭体组织石蜡切片上DPV抗原的间接酶免疫组化法。该法能特异地检测出DPV感染鸭组织中的DPV而对鸭疫里默氏菌、鸭源多杀性巴氏杆菌(5∶A)、鸭源大肠杆菌(O1)感染致死的鸭组织以及正常鸭组织呈阴性反应,检测DPV感染死亡鸭的肝、十二指肠、脑、脾和胸腺的结果与PCR检测结果相同。其敏感性高于原位杂交。对DPV CH强毒株人工感染致死鸭的检测结果表明,该法可特异检测到肝、肺、肾、脑、十二指肠、空肠、回肠、直肠、法氏囊、脾脏、腺胃以及食管中的DPV。DPV主要分布于这些器官的上皮细胞和巨噬细胞。对1992—2004年经10%福尔马林保存的鸭瘟临床病例的肝脏检测结果均为阳性。该法可用于DPV感染鸭的诊断和定位检测,也可用于对甲醛固定组织进行回顾性诊断检测。

间接免疫荧光染色检测石蜡切片中的鸭病毒性肠炎病毒和抗原定位

差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化鸭病毒性肠炎病毒(DEV)免疫兔制备兔抗DEV高免血清后,用DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化的兔抗DEVIgG建立了间接免疫荧光染色法(IFA)检测石蜡切片中DEV的方法。IFA的最佳条件为:石蜡切片用10mmol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液为微波修复液微波修复10min,胰酶修复20min;10%小牛血清室温封闭30min;加入1∶25的兔抗DEVIgG于4℃孵育过夜;再加入FITC标记的羊抗兔IgG于37℃孵育45min。以建立的IFA对DEV人工皮下感染死亡鸭的各组织器官进行检测,在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏中检测到DEV抗原。研究表明,IFA检测石蜡切片中的DEV具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的良好方法。

鸡白色念珠菌的分离鉴定及其防治措施

[目的]寻找鸡白色念珠菌的有效防治措施。[方法]近10年来,从湖北省100多个蛋鸡场收集鸡白色念珠菌病料,对病料进行白色念珠菌的分离和鉴定,探讨该病的初步诊断方法和防治措施。[结果]从832份鸡病料中分离到86株白色念珠菌。从2只鸡的嗉囊炎症部位涂片镜检结果发现,有卵形生芽的或不生芽的酵母状细胞和假菌丝。该病的诊断应以流行病学、症状及病理变化等资料为依据,并结合病原学检查。[结论]可通过向健康鸡群定期投喂"真菌通治"等生物制剂,也可在饲料中添加5.00%大蒜、维生素和0.05%龙胆紫水,改善鸡舍环境条件等措施来预防鸡白色念珠菌。发病鸡则应立即隔离消毒,喂服制霉菌素。

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构观察

通过超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CH强毒株在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的形态结构进行了研究.结果发现,DEV CH强毒株病毒核酸呈圆形颗粒状,直径35～45 nm,在胞核内常集中分布;病毒核衣壳呈圆形,直径90～100nm,在胞核和胞浆内都有分布;DEV核衣壳可根据所含核酸形态的差异分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳;成熟的病毒粒子具有囊膜和皮层结构,呈圆形,直径150～300nm,存在于胞浆空泡内;DEV可在DEF中分别形成胞浆内和胞核内包涵体结构;伴随子代病毒在细胞内的出现,胞浆内还出现豆荚状、马蹄形、半圆形、圆形、同心圆形等与病毒发生有关的电子致密结构.

禽霍乱、新城疫二联油乳剂灭活疫苗研究I报——疫苗的制备、免疫效果及安全性试验

采用新城疫病毒(NDV)Lasota株感染鸡胚尿液毒和多杀性巴氏杆菌(禽A型)接种固体培养基收获菌液,经灭活后制备成油乳剂灭活疫苗,应用该疫苗分别免疫18日龄雏鸡和60日龄以上的青年鸡;18日龄雏鸡免疫量为每只0.25mL,免疫后2周可测到ND抗体HI≥1∶16,3周攻毒ND保护率为100%;90～120日龄鸡免疫量为每只1mL,免疫3周攻毒,禽霍乱保护率为87.5%～100%。安全性试验表明,18日龄雏鸡注射0.5mL、120日龄鸡注射2mL疫苗,观察14天,无不良反应。

禽霍乱-新城疫二联油乳剂灭活疫苗研究Ⅱ报——疫苗的免疫持续期及保存期试验

采用新城疫病毒(NDV)Lasota株感染鸡胚尿囊液毒和多杀性巴氏杆菌(禽A型)接种固体培养基收获菌液,经灭活后制备成5批油乳剂灭活苗(批号2001-1～2001-5),用于免疫2月龄以上的青年鸡,试验分一次免疫组和二次免疫组,分别在免疫后1个月、3个月、6个月、9个月进行ND和FC强毒攻击保护试验,结果表明,相同剂量分两次免疫,近期效果差异不明显。一次免疫组,6个月攻毒ND的保护为100/、FC保护为80/;8个月攻毒ND的保护为95/、FC保护为52.5/。二次免疫组,6个月攻毒ND的保护为100/,HI抗体1∶64以上;FC攻毒保护87.5/;8个月攻毒ND的保护为100/,FC保护为77.5/。疫苗保存期试验证明,4～8℃冰箱保存可达18个月,10～20℃保存的有效期为4个月。

我院静脉用药调配中心药师工作实践及体会

目的完善医院药师在静脉用药调配中心的相关工作内容,保证输液调配质量,确保临床用药安全。方法对医院静脉药物调配中心出现问题进行定性分析,总结药师在静脉药物调配中心工作的作用及意义。结果医院静脉用药调配中心药师发现的问题包括医生医嘱不合理、护士排药及调配差错。结论药师进行医嘱审核、排药复核及调配复核,并对护理人员进行调配指导,层层把关保证调配质量,为临床提供高质量的静脉用药,保证患者用药安全。