目的初步探讨沉默信息调节因子3(silent information regulator 3,SIRT3)在高糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡中的作用,以期为糖尿病肾脏疾病患者肾小管损伤提供新的理论依据和治疗思路。方法通过"Tabula-muris"单细胞转录组数...目的初步探讨沉默信息调节因子3(silent information regulator 3,SIRT3)在高糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡中的作用,以期为糖尿病肾脏疾病患者肾小管损伤提供新的理论依据和治疗思路。方法通过"Tabula-muris"单细胞转录组数据库分析肾组织各细胞亚群SIRT3基因的表达。体外培养人永生化肾小管上皮细胞(HK-2细胞)进行以下分组:(1)对照组、甘露醇组及高糖组。(2)对照组、阴性对照组、过表达SIRT3组、高糖组及过表达SIRT3+高糖组。(3)对照组、阴性对照组、敲低SIRT3组、高糖组及敲低SIRT3+高糖组。(4)对照组、Erastin干预组及过表达SIRT3+Erastin干预组。正常葡萄糖5.5 mmol/L,高糖30 mmol/L,甘露醇24.5 mmol/L,Erastin 10μmol/L,干预时间为48 h。细胞增殖与毒性检测试剂盒实验检测细胞活力。实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测SIRT3、肾损伤分子1及铁死亡相关蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)mRNA和蛋白水平的表达。通过检测丙二醛、谷胱甘肽、铁含量评估细胞铁死亡程度。DCFH-DA法检测细胞内活性氧水平。JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位改变。结果(1)单细胞转录组数据库分析结果显示,SIRT3基因在肾组织近端肾小管上皮细胞亚群中表达最高。(2)与对照组比较,高糖组HK-2细胞肾损伤分子1、ACSL4表达均较高,SIRT3、GPX4表达及细胞活力均较低(均P<0.05),甘露醇组与对照组上述指标的差异均无统计学意义(均P>0.05)。(3)与高糖组比较,过表达SIRT3+高糖组HK-2细胞活力、GPX4表达及细胞内谷胱甘肽均较高,ACSL4表达、细胞内铁、丙二醛及活性氧均较低,线粒体膜电位部分恢复(均P<0.05);与高糖组比较,敲低SIRT3+高糖组HK-2细胞活力、GPX4表达均较低,ACSL4表达较高(均P<0.05),细胞内铁、丙二醛、谷胱甘肽的差异均无统计学意义(均P>0.05)。(4)与对照组比较,Erastin干预组HK-2细胞ACSL4表达较高,GPX4表达较低(均P<0.05);与Erastin干预组比较,过表达SIRT3+Erastin干预组ACSL4表达较低,GPX4表达较高(均P<0.05)。结论高糖可诱导HK-2细胞SIRT3表达下调、线粒体膜电位降低以及氧化应激和铁死亡增加,过表达SIRT3可能通过减少氧化应激及缓解线粒体功能障碍减轻高糖诱导的HK-2细胞铁死亡。展开更多
文摘目的初步探讨沉默信息调节因子3(silent information regulator 3,SIRT3)在高糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡中的作用,以期为糖尿病肾脏疾病患者肾小管损伤提供新的理论依据和治疗思路。方法通过"Tabula-muris"单细胞转录组数据库分析肾组织各细胞亚群SIRT3基因的表达。体外培养人永生化肾小管上皮细胞(HK-2细胞)进行以下分组:(1)对照组、甘露醇组及高糖组。(2)对照组、阴性对照组、过表达SIRT3组、高糖组及过表达SIRT3+高糖组。(3)对照组、阴性对照组、敲低SIRT3组、高糖组及敲低SIRT3+高糖组。(4)对照组、Erastin干预组及过表达SIRT3+Erastin干预组。正常葡萄糖5.5 mmol/L,高糖30 mmol/L,甘露醇24.5 mmol/L,Erastin 10μmol/L,干预时间为48 h。细胞增殖与毒性检测试剂盒实验检测细胞活力。实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测SIRT3、肾损伤分子1及铁死亡相关蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)mRNA和蛋白水平的表达。通过检测丙二醛、谷胱甘肽、铁含量评估细胞铁死亡程度。DCFH-DA法检测细胞内活性氧水平。JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位改变。结果(1)单细胞转录组数据库分析结果显示,SIRT3基因在肾组织近端肾小管上皮细胞亚群中表达最高。(2)与对照组比较,高糖组HK-2细胞肾损伤分子1、ACSL4表达均较高,SIRT3、GPX4表达及细胞活力均较低(均P<0.05),甘露醇组与对照组上述指标的差异均无统计学意义(均P>0.05)。(3)与高糖组比较,过表达SIRT3+高糖组HK-2细胞活力、GPX4表达及细胞内谷胱甘肽均较高,ACSL4表达、细胞内铁、丙二醛及活性氧均较低,线粒体膜电位部分恢复(均P<0.05);与高糖组比较,敲低SIRT3+高糖组HK-2细胞活力、GPX4表达均较低,ACSL4表达较高(均P<0.05),细胞内铁、丙二醛、谷胱甘肽的差异均无统计学意义(均P>0.05)。(4)与对照组比较,Erastin干预组HK-2细胞ACSL4表达较高,GPX4表达较低(均P<0.05);与Erastin干预组比较,过表达SIRT3+Erastin干预组ACSL4表达较低,GPX4表达较高(均P<0.05)。结论高糖可诱导HK-2细胞SIRT3表达下调、线粒体膜电位降低以及氧化应激和铁死亡增加,过表达SIRT3可能通过减少氧化应激及缓解线粒体功能障碍减轻高糖诱导的HK-2细胞铁死亡。