四甲基氯化铵在PCR扩增小麦基因中的关键作用

利用高简并性引物，用ＰＣＲ法从小麦ＤＮＡ或ｃＤＮＡ中合成小麦几丁质酶基因、葡聚糖酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因片段。在ＰＣＲ反应中添加四甲基氯化铵（ＴＭＡＣｌ）是合成这些特异基因片段的关键。合成的ＰＣＲ片段都经末端补齐和磷酸化后用于克隆。核酸序列分析证实，这些ＰＣＲ产物分别与用于设计ＰＣＲ引物的基因具有高度的同源性。

受白粉菌诱导大麦抗感等基因系蛋白质变化的双向电泳分析

分别对接种与否的大麦抗—感白粉病等基因系—叶期幼苗取材进行蛋白质双向电泳分析。结果表明,病原的侵入使抗—感两系在30Kd以下的低分子量区域的蛋白质发生了明显变化。接种48小时之后,抗病系在pH5.5、6.0、6.8及8.8附近出现了对照中所没有的蛋白质,而在pH6.0和8.8附近的蛋白质则较对照有减小的趋势;感病系在pH6.0附近蛋白质明显增多,在pH8.8处不仅在量上有大幅度提高,而且种类也有增加。结果还表明,抗—感系间在未接种的情况下双向电泳图谱也有差异,接种之后由于感病系在pH8.8处蛋白质的特异性合成,使抗—感两系间的差异缩小。

小麦苯丙氨酸解氨酶基因和几丁质酶基因转录起始点的鉴定

本文应用改良的引物延伸法，鉴定了一个小麦的苯丙氨酸解氨酶和几丁质酶基因的转录起始点。这种方法只需少量同位素，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５柱和严格的杂交条件。利用两种基因的特定引物及总ＲＮＡ进行的引物延伸反应产物在电泳的凝胶上均呈现一条十分清楚的带，表明这两种多拷贝小麦基因的转录分别起始于一个核苷酸。小麦苯丙氨酸解氨酶基因的转录起始点为５′－ＣＴＧＣＣＧＡＧＴ－３′序列中的第２个Ｃ；而小麦几丁质酶基因转录起始点为５′－ＡＴＣＡＣＣＡＧＣ－３′序列中的第２个Ａ。它们都分别位于各自基因ＴＡＴＡ盒的下游。

禾谷镰刀菌培养性状与致病力的相关性分析

选择来自我国12省市有代表性的101株禾谷镰刀菌菌株,比较它们在PDA培养基上的表型性状以及在CMS液中的产孢量;并于田间小麦开花期,用单花剪滴法接种3个抗赤霉病性不同的小麦品种,鉴定其致病力,用SAS软件进行统计分析。结果表明,菌落扩展速度不同的菌株间,其致病力差异显著;相关分析证实, 菌落扩展速度与致病力之间呈极显著线性正相关(P=0.000 3),菌丝生长状况与致病力之间呈极显著非线性相关(P=0.008 3),而基质颜色和产孢量与致病力没有相关性。这些结果说明,禾谷镰刀菌菌落的扩展速度及菌丝生长状况与致病力之间具有共同的遗传基础或遗传相关性。

小麦和玉米籽粒赤霉菌产毒类型的PCR检测

为了建立一种准确、快速鉴定赤霉菌毒素的方法,根据赤霉菌毒素生物合成调控路径T ri5-T ri6基因保守序列,设计了一对通用引物,用于检测和鉴别产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(N IV)毒素的赤霉菌特异DNA片断。结果表明,产生毒素DON的赤霉菌具有一个300 bp的特异DNA片断,而产生毒素N IV的则为360 bp。PCR检测与HPLC或GC/M S化学分析结果完全一致。利用这一方法分析检测了小麦、玉米籽粒中赤霉菌产毒类型,发现除健康籽粒外,在所有轻微、中度、严重感染赤霉病的小麦或玉米籽粒中,均同时检测到DON及N IV的两种DNA片断,表明这一对通用引物对两种毒素特异DNA片断的扩增效率相同。这些结果说明,该技术是一种经济、快速、可靠的PCR检测技术,可广泛用于赤霉菌及其毒素检测鉴定中。

小麦穗发芽抗性与选择效应研究

2005年在小麦收获期,对124份材料进行了种子发芽和穗发芽抗性比较,筛选出抗性差异显著的材料196份;2006年在小麦生理成熟期,抗穗发芽鉴定了179个品种及上一年筛选的全部材料。结果表明,品种间穗发芽抗性差异十分显著。不同材料的种子发芽率和穗发芽率在收获期的分布范围分别为20%-100%和18%-100%;在生理成熟期的分布范围均为0%-100%,其中两者均在10%以下的抗性品种占4%。红粒品种整体上的抗性高于白粒品种,但也存在白粒抗性品种。同一品种个体间的抗性差异较大,表明通过筛选可以获得抗穗发芽资源。种子休眠是抗穗发芽的重要因素,品种穗部特征对穗发芽亦有影响。

不同小麦品种成熟胚愈伤组织诱导及分化的研究

以长江流域及华中地区推广的24个小麦品种为材料,分析、比较其成熟胚在3种诱导培养基和1 种分化培养基上的愈伤诱导和分化频率。结果表明:不同诱导培养基在愈伤诱导率上存在显著差异,添加ABA的MB5培养基诱导效果最佳;不同小麦品种对培养条件的反应不同,华9943、华9914等4 个品种在3 种培养基上的诱导频率相同,而其余品种在3种培养基上的愈伤诱导率差异极显著。在分化绿点和成苗率上,品种间差异十分明显,农大146、苏麦6号、扬麦158、华麦12号和华麦8号的再生力强。因此,在小麦成熟胚培养中,筛选优良的基因型—培养基组合是必要的。

禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选与鉴定

从土壤中分离获得1株具有较强拮抗作用的细菌菌株X-42,经形态特征、16S rDNA序列分析,将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该菌可产生一系列具有抑菌功能的代谢物,抑制禾谷镰刀菌生长。从X-42菌株发酵液中分离纯化代谢物,经硫酸铵沉淀的脂肽类物质用于抑菌分析,结果表明,来自X-42的脂肽物,既能直接破坏禾谷镰刀菌菌丝结构,也能影响分生孢子萌发,导致菌丝及孢子局部膨大。小麦开花期的田间赤霉病防治研究表明,在接种禾谷镰刀菌前和接种后施用拮抗菌X-42代谢物,均可有效防治赤霉病,其防治效果高达79%～88%,与化学杀菌剂多菌灵相当。

镰刀菌毒素及其分子生物学研究进展

综述了近年来国内外关于小麦赤霉菌主要致病菌种禾谷镰刀菌毒素的形成与致病力的关系、毒素生 物检测及免疫化学检测方法、脱毒技术及毒素代谢途径的分子生物学研究的一些进展。

小麦茎尖丛生芽诱导及植株再生

为了筛选不受季节限制的小麦遗传转化受体,研究了3个小麦栽培品种在3种萌发培养基、4种诱导培养基、3种不同诱导时间和3种生根培养基下从茎尖直接诱导丛生芽的最佳条件和方法。结果表明,MB5基本培养基不添加任何激素最适于小麦成熟胚萌发;而在MB5培养基中添加1.0 mg/L TDZ和0.5 mg/L IBA,小麦茎尖丛生芽诱导率最高;单个茎尖形成丛生芽的数目,随诱导时间延长而增加,诱导时间以不超过30 d为宜;品种间的丛生芽诱导率及丛生芽形成数目没有差异;最佳生根培养基为1/2 MS基本培养基添加1.0 mg/LIBA。由丛生芽诱导再生发育形成的植株开花结实正常。这些研究结果为建立基于小麦丛生芽的再生及遗传转化体系提供了方法。

中国与欧洲禾谷镰刀菌DON毒素HPLC定量比较分析

选用4个来自中国、7个来自欧洲的代表性禾谷镰刀菌菌株，经脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）毒素特异引物鉴定，确认其具有产生DON毒素的遗传物质基础后，接种于PDB培养基培养7d，从培养基上清中经硅胶柱分离、纯化DON毒素，经HPLC定量分析表明，纯化的禾谷镰刀菌DON毒素，与购自公司的DON毒素标准样品一样，其HPLC检测谱峰清晰明显，基线平稳，无干扰，保留时间为9．5min左右；供试菌株的DON毒素含量分布在0．023～1．934μg／mL之间，德国菌株F703产毒量最大，比位居第二的中国菌株5005（1．232μg／mL）高57％；其余的6个欧洲菌株中，除意大利菌株Lor9（0．128μg／mL）略低于另一个中国菌株7105（0．135μg／mL）外，均比3个中国菌株（4020、7105、8029）的产毒量大．欧洲镰刀菌产生DON毒素的能力远远大于中国菌株，这说明欧洲菌株长期在欧洲生态环境下已演变形成其特有的高毒素代谢类型，我国有必要严防欧洲禾谷镰刀菌入侵，加强对来自欧洲的禾谷类粮食及其产品的镰刀菌和毒素的检疫和监控；同时，本研究建立的毒素样品制备与HPLC检测体系可用于准确定量分析样品的DON毒素．

伏马菌素B_1特异单链抗体的同源建模及分子对接模拟研究

目的分析伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)与其特异单链抗体的分子互作模式。方法通过同源建模构建和优化抗FB1单链抗体的三维结构,结合Procheck和Verify 3D等方法评价得到稳定的抗体模型,利用分子对接研究单链抗体与其抗原FB1的结合特性、疏水性和表面静电力作用。结果单链抗体的互补决定区参与同其抗原FB1的结合,抗体与抗原之间不仅形成稳定的氢键,疏水性和静电力的匹配也很好。结论氢键结合力、分子间疏水相互作用和静电力的共同作用,使得单链抗体形成一个能够与FB1高度互补的相互作用区域,并在抗体与抗原的特异性识别及结合稳定性等方面起着关键作用。

不同小麦品种愈伤组织诱导和再生体系建立

为了筛选适合组织培养的小麦基因型,建立一套有效的小麦诱导再生体系,以24个小麦品种的幼胚为研究材料,选用4种诱导培养基和3种分化培养基,研究了影响小麦组织培养的各种因素。结果表明:1培养基之间存在显著差异,MM2培养基的诱导效果最好,平均诱导率为98.5%;M5B培养基的分化效果最佳,平均分化率为39.8%。2不同品种在诱导愈伤和分化再生上都有显著的基因型差异。3愈伤组织诱导率和分化率之间无显著相关性。

低温和诱导时间对小麦小孢子培养的影响

为了优化小麦小孢子培养体系,研究了低温处理花药、幼穗及诱导培养时间对小孢子形态、胚胎发生和植株再生的影响。结果表明,经低温处理后,有活力的小孢子体积增大、形态变化明显,据其液泡大小、数目及其与细胞核位置的关系,可分为4种类型。低温处理可显著提高胚状体数和绿苗数,其中处理花药3 d、幼穗7 d的效果最好,平均每皿的绿苗数分别为59株和57株。胚状体发育速度显著影响绿苗分化能力,小孢子诱导培养28-29 d、直径约2 mm的胚状体数目较少,但绿苗分化率高;诱导培养32-38 d、直径为2 mm的胚状体数目达到了峰值,而绿苗分化率极低。在小麦小孢子培养中,应选择诱导28-29 d、直径2 mm的胚状体进行分化培养。

两个小麦遗传群体不同年份和地点赤霉病抗性鉴定与比较

通过对两个小麦遗传群体 (“望水白”/“Alondra”和“苏麦 3号”/Alondra)在南京、苏州、建阳、武汉 4个地点连续两年 (1999～ 2 0 0 0年 )的抗赤性鉴定资料分析发现 ,抗、感性稳定品种的抗赤性以及遗传群体内个体抗、感趋势和病小穗率的频率分布均较一致。但无论是同一年份的不同地点间 ,还是同一地点的不同年份间 ,遗传群体内个体抗赤性的相关系数极小。这使小麦抗赤性分子标记的QTL分析受到影响。文章对抗赤性鉴定方法和抗赤性评价问题进行了讨论 。

甘露糖对小麦不同外植体愈伤诱导及生长的影响

为了给以磷酸甘露糖异构酶基因作为筛选标记的小麦遗传转化提供资料,以小麦栽培品种扬麦158和华麦13的茎尖、叶基、成熟胚为外植体,研究了不同甘露糖浓度对这些外植体愈伤组织诱导和生长培养的影响。结果表明,10 g/L的甘露糖使茎尖的出苗和生根受到明显抑制,而茎尖幼苗对甘露糖的耐受力较强,15 g/L甘露糖才能有效抑制幼苗生长。叶基在5 g/L甘露糖时,其愈伤组织诱导率降低55%,而成熟胚在10或15 g/L甘露糖时的愈伤组织诱导率与叶基在5 g/L甘露糖时相当。这些结果说明,在以小麦叶基、茎尖和成熟胚为外植体的PMI/甘露糖筛选中,可分别以5、101、5 g/L甘露糖作为筛选压。另外,培养时间不同的外植体或培养物对甘露糖敏感性不同,在培养早期阶段筛选时,可选较低的甘露糖筛选压,而在后期培养阶段进行筛选时,可适当提高筛选压。

玉米赤霉烯酮快速间接竞争酶联免疫检测技术研究及应用

在获得高特异性单克隆抗体的基础上,通过间接竞争酶联免疫检测技术建立了一种在室温下(25℃)快速、定量检测玉米赤霉烯酮的方法。该方法前处理简单,检测时间仅30 min,检出限为0.3μg/kg,线性范围0.5-10μg/kg,回收率为76.7%-104.2%。应用此方法测定了16份小麦、玉米等谷物样品中玉米赤霉烯酮的含量,其中小麦9份、玉米7份,检出率为69%,含量在5.12-400.02μg/kg,其中2份样品为阳性。同时该ELISA检测结果与LC-MS/MS的验证结果无显著性差异。因此,该新型快速、定量的ELISA技术对小麦、玉米样品中玉米赤霉烯酮的大范围筛查具有一定的应用价值。

抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究

通过优化诱导表达条件,实现抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌周质中高效可溶性表达。将抗镰刀菌单链抗体FvSG7转化到大肠杆菌XL1-Blue中,确定诱导表达培养基,在不同的诱导温度、诱导剂IPTG的浓度和诱导时间条件下培养重组大肠杆菌,通过Western杂交和ELISA检测分析单链抗体的可溶性表达情况以及抗体的活性。重组大肠杆菌培养至OD600nm为0.5时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG,25℃诱导表达2 h可获得最大量的可溶性单链抗体。通过对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化,可以显著提高Fv SG7抗体在大肠杆菌XL1-Blue周质中的表达量。