外耳道真菌病致病曲霉菌菌种鉴定及药物敏感性检测

目的鉴定外耳道真菌病的致病曲霉菌种,并检测它们对常用抗真菌药物的敏感性。方法收集2020年10月至2021年5月诊断为外耳道真菌病的94例患者,外耳道分离真菌检测均为曲霉菌,采集患者外耳道排出物,行真菌涂片荧光染色镜检,同时行真菌培养,对培养后的菌落提取真菌DNA行ITS区扩增并测序分析。选取4种常用的抗真菌药联苯咔唑(PCB)、克霉唑(CLO)、特比萘芬(TRB)和伊曲康唑(ITR)行抗真菌药物敏感性检测。结果94例患者外耳道真菌病患者中共分离获得5种曲霉菌,其中土曲霉菌48株(51.1%),黄曲霉菌25株(26.6%),黑曲霉菌13株(13.8%),烟曲霉菌7株(7.4%),花斑菌霉菌1株(1.1%)。药敏结果显示,22株黄曲霉菌对PCB耐药(MIC>16μg/ml),耐药率88.0%;7株对CLO耐药(MIC>16μg/ml),耐药率28.0%。黑曲霉菌4株对PCB耐药(MIC>16μg/ml),耐药率30.8%;5株对CLO耐药(MIC>16μg/ml),耐药率38.5%。烟曲霉菌2株对PCB耐药(MIC>16μg/ml),耐药率28.6%;2株对CLO耐药(MIC>16μg/ml),耐药率28.6%。土曲霉菌4株对PCB耐药(MIC>16μg/ml),耐药率8.3%;17株对CLO耐药(MIC>16μg/ml),耐药率35.4%。所有曲霉菌仅有1株黑曲霉菌对ITR耐药(MIC>8μg/ml),1株土霉菌对TRB耐药(MIC>8μg/ml)。结论土曲霉菌是本组外耳道真菌病患者分离出的最常见的曲霉菌菌种。曲霉菌对PCB和CLO耐药率相对偏高,而对TRB和ITR耐药率极低,故治疗外耳道真菌病时应首选TRB或ITR。

氢氧机在抗真菌辅助治疗中的效果评价及机制初探

目的基于体外试验研究氢氧机单独应用或联用抗真菌药对真菌的作用效果及作用机制。方法选择临床分离获得的12株病原真菌作为试验菌株,使用氢氧机按固定的流速和档位(气流量3 L/min,雾化档5档)处理菌悬液,以通气0 min时(未通气时)和通气处理菌悬液5、10 min时为3个观察时点,各时点分别取菌悬液100μL涂布于沙氏葡萄糖琼脂培养基,于37℃温箱内培养2 d后进行菌落计数,计算存活率和杀伤率。采用微量液基稀释法测定4种抗真菌药伏立康唑(VOR)、泊沙康唑(POS)、氟康唑(FLU)、伊曲康唑(ITR)的最低抑菌浓度(MIC)。应用流式细胞仪测定细胞内活性氧(ROS)活性变化。结果氢氧机5 min通气处理对12株菌株的杀伤率与通气0 min比较,差异均有统计学意义(P<0.05),整体杀伤率范围为6.3%~76.2%;与5 min通气处理相比,氢氧机10 min通气处理对12株菌株的杀伤率增高,差异均有统计学意义(P<0.05),整体杀伤率范围为19.6%~93.5%。菌悬液体外药敏试验结果显示,氢氧机通气处理10 min后,ITR、POS、VOR对菌株的MIC值下降了1~4倍,FLU对菌株的MIC值降低了1~5倍;高浓度氢气处理后,抗真菌药对其中11株菌株的MIC值明显降低。对经过不同时间通气处理的ATCC00279菌株进行细胞内ROS检测发现,与通气0 min比较,通气10 min后菌株对ITR、VOR的ROS百分比增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论单独氢氧机通气处理即可实现高达93.5%的菌株杀伤效果,将其与抗真菌药联用还可使菌株对药物的敏感性增强,进一步降低抗真菌药对真菌的MIC,其机制可能与氢氧机能增强真菌细胞内ROS活性有关。

烟曲霉FADB基因参与菌株耐药的潜在机理

FAD结合的氧化还原酶编码基因FADB(GenBank ID:Afu4g14630)的编码产物在烟曲霉中为一种与FAD结合的氧化还原酶,可能参与真菌的呼吸。为了探究其具体功能,本研究通过克隆烟曲霉FADB基因,构建烟曲霉FADB基因的敲除株,了解该基因对烟曲霉药物敏感性、渗透压、氧化压力物质敏感性的作用机理。采用高通量基因替换方法构建出FADB基因的敲除盒,筛选出符合的烟曲霉FADB敲除株ΔFADB。观察该突变株与野生株AF293对药物敏感性、氧化压力、渗透压物质敏感性的变化。利用E-test法检测ΔFADB对3种唑类药物(泊沙康唑、伊曲康唑、伏立康唑)的敏感性,结果证实ΔFADB对泊沙康唑的敏感性明显提高。在渗透压和氧化压力的培养试验中,与野生株AF293相比较,ΔFADB对氧化剂D-山梨醇和甲萘醌更敏感。加入泊沙康唑后,ΔFADB比野生株AF293产生的活性氧更多。说明烟曲霉FADB基因参与泊沙康唑抗烟曲霉机制并起到一定作用,该基因诱导的氧化应激反应可能是抗真菌药物杀伤真菌的作用机制之一,本研究为烟曲霉唑类耐药机制的研究提供了新的理论基础。