分光光度法检测心肌线粒体渗透性转换

目的 :线粒体渗透性转换 (mitochondriapermeabilitytransition ,MPT)是反映线粒体膜完整和功能的重要指标。它的测定是根据MPT增大时线粒体膜内外渗透失衡 ,导致吸光度明显减少的原理。我们参照国外文献资料 ,结合本实验室的条件 ,采用UV 2 40分光光度计 ,建立了分光光度法测定心肌线粒体渗透性转换。方法 :以其在 5 40nm波长下吸光度减少的幅度及达到平衡所用的时间ΔA/min值反映MPT的变化。结果和结论 :通过观察测定体系中不同 pH值 ,不同线粒体蛋白量 ,以及不同温度条件下对线粒体PT的影响 ,认为pH7.4、0 .5mgpro/ml线粒体以及 2

应激心肌损伤的蛋白质组学研究

目的:寻找应激心肌损伤相关蛋白。方法:建立束缚应激心肌损伤模型,制备心室肌2DE蛋白样品和心肌2DE图谱,图像分析软件分析应激后蛋白表达差异点,MALDI TOF MS数据库搜索鉴定蛋白质。结果:应激前后10个蛋白表达量发生改变,其中8个应激后表达显著升高,经质谱鉴定为心肌肌球蛋白、白蛋白、脂蛋白A I前体等;2个显著降低,经质谱鉴定为线粒体能量代谢酶类和UCP3。结论:这些差异蛋白可能参与应激机体心肌损伤的发生。

应用核糖体展示技术筛选制备抗TNF-α人源抗体的研究

目的:构建人源核糖体展示抗体库,筛选制备抗TNF-α的特异性、高亲和力三结构域抗体(VH/K)。方法:应用核糖体抗体库技术,从类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示VH/K基因库;体外转录翻译后,以TNF-α重组蛋白作纯化抗原,采用亲和富集法淘选TNF-α特异性抗体基因;将筛选获得的VH/K基因克隆并在原核系统pET22b(+)/BL21(DE3)中实现可溶性表达;表达产物经进行ELISA鉴定,并对阳性克隆的生物学特性进行初步研究。结果:成功构建了库容量约为6.7×1012核糖体展示VH/K抗体基因库,在180个筛选克隆中,其中两株抗体TRB21、TRB409显示出极高的ELISA值,序列分析表明两株克隆具有全新的人源抗以TNF-α抗体基因,他们不仅可以特异识别TNF-α而且可以抑制以TNF-α对L929细胞的细胞毒性。结论:人源抗TNF-α特异性抗体的获得,为进一步研制抗TNF-α的特异性、高亲和力基因工程抗体奠定了基础。核糖体展示技术为体外筛选制备全人源抗体提供了一种简便、有效的技术平台。

束缚应激致大鼠心肌损伤的线粒体膜机制探讨

目的观察束缚应激对大鼠心肌细胞线粒体膜生物学特性和功能的影响 ,探讨应激性心肌损伤的线粒体膜机制。方法建立应激动物模型 ,分别束缚不同时间后处死所有大鼠 ,检测线粒体PTP开放程度、膜流动性的改变、膜脂质过氧化水平及线粒体呼吸功能变化。结果束缚应激导致线粒体膜PTP开放、膜流动性降低、膜脂质过氧化物生成增多及线粒体呼吸功能损害 ,且随着束缚时间增加 ,以上各项指标改变加剧。

同型半胱氨酸对心肌细胞的损伤作用及其信号转导机制探讨

目的 :观察同型半胱氨酸 (homocysteine ,HCY)对心肌细胞的损伤作用 ,探讨该作用发生的信号转导机制及其关键调控环节。方法 :分离培养Wistar乳鼠心肌细胞 ,经HCY作用后 ,以台盼蓝排斥实验测定细胞存活率 ,TUNEL法和流式细胞仪测定细胞凋亡率 ,免疫印迹法测定心肌细胞ERK2蛋白磷酸化水平 ,阻滞电泳法测定细胞NF κB活化水平。结果 :作用后 ,心肌细胞存活率显著降低 ,存活率降低程度与HCY的作用浓度、作用时间具有明确的剂量 效应关系及时间 效应关系 ;在 1 0 - 3mol/LHCY作用下 ,心肌细胞凋亡率升高 ,于 4h达峰值 ,为 7.56 % ;1 0 - 3、1 0 - 4、1 0 - 5mol/LHCY均可抑制心肌细胞ERK2磷酸化 ,其中 1 0 - 3mol/LHCY作用于心肌细胞后 ,ERK2蛋白磷酸化水平呈现迅速而明显的降低 ,4h降至对照组的 3 .0 4 % (P <0 .0 1 ) ;不同浓度HCY均明显阻抑NF κB的活化。结论 :HCY具有明显心肌细胞损伤作用 ,对心肌细胞凋亡的诱导是HCY心肌细胞损伤作用的形式之一 ;HCY可影响心肌细胞信号转导通路ERK ,并通过对转录因子NF κB的活化抑制 。

中药复方对热应激大鼠的抗热效果

目的 研制中暑防治新型中药复方及其效果评价。方法Wistar大鼠随机分为对照组和给药组,观察在高温条件下(仓温:38℃、RH:80％)中药复方对大鼠肛温、心电图、血浆LDH水平的影响及其抗疲劳作用。结果热暴露1 h后,大鼠1 d和3 d给药组肛温与各自的对照组比较,升高幅度分别降低17％和13％(P<0.05);1 d和3 d对照组的大鼠心率分别为(530±52)b·min-1和(576±23)b·min-1,显著高于正常组[(465±19)b·min-1,P<0.05],而1 d和3 d给药组分别为(506±21)b·min-1和(523±27)b·min-1,与正常组无显著性差异。给药组心电图R波幅,与各自的对照组都有显著性差异(P<0.05)。但1 d和3d给药组之间在肛温、心率、R波幅均无显著性差异。热暴露后,对照组血清LDH活力升高75.6％(P<0.05),药物组升高15.2％(P>0.05);抗疲劳试验表明,药物组比对照组大鼠游泳时间提高3.85倍(P<0.01)。结论本抗热中药复方可以显著增强大鼠热耐受能力,减轻机体热损伤,并提高运动能力。

热应激心肌细胞损伤的线粒体机制探讨

目的 :观察热应激对大鼠心肌细胞线粒体氧化磷酸化和钙代谢功能的影响、研究线粒体膜渗透性转换 (PT)的变化及其病理学意义、探索热应激心肌细胞损伤发生机制。方法 :用Klark氧电极极谱法测定线粒体呼吸功能 ,用生物发光法测定心肌ATP含量及线粒体Ca2 +。ATP酶活性 ;用电感耦合等离子 原子发射光谱仪测定线粒体内Ca2 +含量 ,用分光光度法测定线粒体膜PT。结果 :热应激大鼠心肌细胞线粒体的呼吸控制率 (RCR)及氧化磷酸化效率 (P/O)均随热应激强度的增强呈显著逐步降低趋势 ;心肌线粒体Ca2 + ATP酶活性和Ca2 +含量亦明显下降 ;暴露于Ca2 +超载和氧化应激状态的线粒体 ,膜PT发生明显变化 ,钌红、抗氧化剂及反应体系酸化状态的纠正能够有效阻抑PT变化。结论 :线粒体结构与功能的破坏在热应激机体心功能损伤的发生中有着极其重要的意义。

预热诱导心肌细胞表达Hsp70对Fas通路活化后细胞凋亡变化的研究

目的:研究Hsp70对Fas通路活化后细胞凋亡的作用及其可能机制。方法:水浴预热诱导培养新生大鼠心肌细胞Hsp70表达,Fas抗体活化Fas通路,Westernblot测定Hsp70的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,特异性底物测定caspase-8及caspase-3的活力。结果:预热可以使心肌细胞Hsp70表达升高,Fas抗体降低细胞凋亡率,高表达Hsp70可以降低Fas通路活化后心肌细胞凋亡率,同时相应使caspase-8及caspase-3活力升高的幅度降低。结论:Hsp70可能通过抑制caspase-8及caspase-3的活力而降低Fas通路活化后培养新生大鼠心肌细胞凋亡的发生。

慢性应激大鼠海马的比较蛋白质组学研究

慢性应激可造成海马神经细胞丢失、树突萎缩等损伤,但有关其损伤机制仍有很多问题不甚明了.为了寻找应激致海马损伤相关的重要蛋白质、从蛋白质水平揭示应激致海马损伤的分子机制,应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离对照组和束缚应激组大鼠海马组织总蛋白质,图像分析检测差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和数据库检索对差异表达的蛋白质点进行鉴定,并采用半定量的RT-PCR在mRNA水平验证2-DE结果.得到了分辨率较高、重复性较好的对照和束缚应激大鼠海马2-DE图谱,质谱分析和数据库检索鉴定了14个差异表达蛋白质点中的11个蛋白质,大多数差异蛋白的功能涉及能量代谢、信号传递等过程.研究结果为揭示应激致海马损伤的机制、提高机体的应激适应能力提供了理论依据.

bcl-2基因转染对热应激心肌细胞保护作用的机制探讨

目的 :探讨bcl 2基因转染对热应激心肌细胞保护作用的机制。方法 :分离、培养乳鼠心肌细胞 ,用脂质体转染法将bcl 2基因转染入心肌细胞 ,进行热应激。用化学发光法测定bcl 2基因转染对热应激心肌细胞线粒体H+ ATPase合成活力的影响 ,用荧光分光光度法测定bcl 2基因转染对热应激心肌细胞Caspase3活性的影响。 结果 :bcl 2基因转染可以使 4 1℃和 4 3℃热应激心肌细胞线粒体H+ ATPase合成活力与转染前相比显著升高 (P <0 .0 1) ,可以使 4 1℃和 4 3℃热应激心肌细胞Caspase3活性与转染前相比显著降低 (P <0 .0 1)。结论 :bcl 2基因转染对热应激心肌细胞凋亡的保护作用可能与其保护心肌细胞线粒体H+ ATPase合成活力 。

预热应激对缺氧血管内皮细胞的保护作用及其机制

目的 :研究预热应激对缺氧血管内皮细胞的保护作用及其发生机制 ,探索新的防治措施。方法 :将血管内皮细胞分为 :(1)缺氧组 ;(2 )热应激组 ;(3)预热应激 +缺氧组 ;(4)对照组。用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)活性 ,以台盼兰染色法测定细胞死亡率 ,用Griess化学法测定细胞培养液中NO-2 含量 ,以观察细胞NO生成量。结果 :缺氧血管内皮细胞LDH的释放量和细胞死亡率显著大于对照组 ,39℃预热应激可使其分别降低 2 9 47%和 33 6 7% ,41℃预热应激对缺氧细胞无明显保护作用。缺氧使血管内皮细胞NO生成量显著降低。39℃预热应激的缺氧血管内皮细胞NO生成量显著高于缺氧组 ,41℃预热应激的缺氧血管内皮细胞NO生成量显著低于对照及相应的缺氧组 ;血管内皮细胞NO生成量与细胞LDH释放量及细胞死亡率呈显著负相关。结论 :一定强度的预热应激可以对缺氧血管内皮细胞产生保护作用。

演习人员外周血淋巴细胞热休克蛋白70的表达及相关因素分析

目的观察军事演习与热休克蛋白70表达的关系,并分析影响演习人员热休克蛋白(heat shock protein 70,HSP70)表达的因素。方法某次演习期间,选取参演官兵137人为演习组,观摩演习官兵50名为对照组。问卷调查一般情况和心理应激状况,进行身体测量和血乳酸测定,采用Western blotting法检测外周血淋巴细胞中HSP70的表达水平。组间比较采用t检验,采用多元线性回归分析考察相关影响因素。结果与对照组比较,演习组外周血淋巴细胞HSP70水平显著增加(0.39±0.06vs0.60±0.09)(P<0.01),这种表达与年龄、受教育程度、家庭人口、吸烟、血乳酸和心理应激状况自评得分相关(P<0.05,P<0.01),与体质量指数(body mass index,BMI)、收缩压、白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)等无明显相关(P均>0.05);多元线性回归分析显示血乳酸、心理应激状况和受教育程度是影响演习人员HSP70表达的最显著的因素。结论演习人员外周血淋巴细胞HSP70表达水平升高,这种升高与血乳酸、心理应激状况自评得分和受教育程度等相关。

大白鼠模拟低氧性间质肺水肿的形态学研究

本文报告了大白鼠在小减压舱减压缺氧条件下间质肺水肿发生的模拟条件。结果表明，低氧性间质肺水肿主要发生在细支气管动脉周围腔内。不同模拟减压高度和阶段升高减压缺氧各组，以６ｋｍ这一模拟高度间质肺水肿发生的程度最重。该高度减压缺氧４ｈ、８ｈ和１２ｈ组与常压对照组定量图像分析结果比较，差别均非常显著。雌性对照大鼠间质肺水肿定量图像分析结果以８ｈ最为显著、２４ｈ次之，４８ｈ最轻。可见，６ｋｍ减压缺氧８ｈ为产生低氧性间质肿水肿最为适宜的模拟条件。

血清蛋白质组学在中医证型研究中的技术优化

目的:建立并优化血清蛋白质组二维凝胶电脉(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离技术,并将其运用于中医证型研究。方法:在常规蛋白质组2-DE分离技术的基础上对血清样品处理、胶条选择、上样量和聚焦参数等加以优化并摸索新的方法。结果:建立了稳定的血清蛋白质组2-DE分离技术,运用于肝郁证的研究并取得理想结果。结论:方法具有稳定性、可重复性,为进一步研究血清相关蛋白质组及中医证型奠定基础。

应激对大鼠心肌细胞线粒体膜通透性转换孔开放的影响及其分子基础的研究

目的 :观察应激对大鼠心肌线粒体膜通透性转换孔 (PTP)开放的影响 ,探讨PTP开放的分子基础。方法 :建立应激动物模型 ,分别束缚不同时间后处死所有大鼠 ,分光光度法检测线粒体PTP开放程度、Westernblot方法检测线粒体Bcl- 2、Bax蛋白表达水平。结果 :应激可导致大鼠心肌线粒体膜PTP开放 ,Bcl- 2表达水平降低、Bax水平增高。结论 :PTP开放为应激性心肌损伤的重要线粒体机制 ;Bcl- 2表达降低、Bax水平上调则为PTP开放的重要分子基础。

人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)表达及抗体制备

目的重组表达及纯化人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(betaine-homocysteine methyltransferase,BHMT)蛋白,制备BHMT多克隆抗体并对其性质进行研究。方法 TRizol法提取人HepG2细胞总RNA,RT-PCR获得BHMT基因,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建重组表达载体pET-28a-BHMT,经0.5 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物通过Ni柱亲和纯化获得重组蛋白;以重组BHMT蛋白免疫兔,获得兔多克隆抗体,并对抗体进行纯化,应用Western印迹方法分析其识别人天然BHMT蛋白的能力。结果经测序证明,RT-PCR得到的人BHMT基因与Gen-Bank中人的BHMT基因完全一致;构建的BHMT原核表达载体可稳定地表达可溶性人BHMT蛋白;重组BHMT蛋白免疫兔后,兔血清抗体纯化获得高纯度BHMT抗体,此抗体可以特异性地识别人肝癌组织中的天然BHMT蛋白。结论成功重组表达并纯化人BHMT蛋白,所获得的BHMT多克隆抗体可以应用于人BHMT蛋白的检测,为研究BHMT在高同型半胱氨酸血症中的作用机制奠定基础。

柱后辅助有机溶剂喷雾对液相色谱-电喷雾-质谱分析的影响

溶剂的组成影响电喷雾离子(ESI)化效率。该研究观察了ESI溶剂体系中不同浓度的乙腈(ACN)对MRFA、Reserpine、ΜLtramark1621、马肌球蛋白酶切肽段等标准物质的质谱信号响应强度的影响,发现在溶剂体系中,ACN浓度达到70%时,上述物质的质谱信号强度具有最大值。根据这一现象,对传统的反相色谱-电喷雾-质谱(RPLC-ESI-MS)系统进行管路改造,在分析柱后通过1个三通阀引入适当流速的有机溶剂进行辅助喷雾。对马心肌蛋白酶切肽段混合物的分析表明,该方法可以有效提高酶切肽段的检出率,并提高鉴定蛋白质的序列覆盖率。

过热大鼠加压素分泌活性的研究

应用电镜和免疫组化方法研究大鼠神经垂体在过热状态下的形态学变化。主要表现为充满神经分泌颗粒的贮存型Ａ型神经纤维膨体的数量明显减少；而其它各分泌活跃型膨体的数量明显增多。还可见Ａ型神经纤维发生变性，个别垂体细胞坏死。上述改变表明神经垂体在超负荷情况下加压素分泌亢进，最终导致功能衰竭。

大白鼠减压缺氧性肺水肿的形态计量研究

实验采用形态计量方法探讨大白鼠模拟６ｋｍ减压缺氧、４、８和１２ｈ条件下间质性肺水肿（ＩＰＥ）和冷水游泳负荷后８ｋｍ减压缺氧３－６ｈ肺泡性肺水肿（ＡＰＥ）的发生情况。结果表明，６ｋｍ减压缺氧各组，肺细支气管动脉周围腔明显扩大，冷负荷后缺氧肺水肿的面积较单纯８ｋｍ减压缺氧组和单纯冷负荷后缺氧组有显著性差别。