改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定

目的 :改良大鼠肝星状细胞 (hepaticstellatecells,HSC)的分离培养及鉴定方法 ,使之简便易行 ,高效可靠。方法 :采用肝离体胶原酶灌注消化 ,低速离心去除肝细胞 ,密度梯度离心法分离HSC ,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率 ,desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定HSC纯度。结果 :采用改良法 ,每只大鼠的HSC得率为( 2 .5 4± 0 .13)× 10 7个 ,细胞活率为 ( 98.8± 0 .7) % ,高于旧方法的HSC得率 [( 2 .18± 0 .18)× 10 7个 ,P <0 .0 1]和活率 ( 94.3± 0 .6 ) % ,P <0 .0 1]。用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定 ,HSC纯度为 ( 96 .8± 1.0 ) % ,高于单用desmin鉴定的纯度 ( 91.8± 2 .2 ) % (P <0 .0 1)。结论 :改良的大鼠HSC分离培养方法简便易行又经济 ,在保证纯度的同时 ,提高了得率和活率。采用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定细胞纯度 。

携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨

目的 构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法 以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果 重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论 成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,

重组腺相关病毒介导抑癌基因联合诱导人肝癌细胞系凋亡与生长抑制研究

目的观察腺相关病毒介导的抑癌基因p5 3,p16和p2 1联合治疗肝癌的可能性和效果。方法用携带人野生型p5 3,p16和p2 1的腺相关病毒分别或联合转导人肝癌细胞系HLE ,HepG2 ,QGY 770 1,QGY 770 3,BEL 74 0 2 ,SMMC 772 1,通过体外及裸鼠体内实验研究转基因的表达及对癌的促凋亡和生长抑制作用。结果腺相关病毒介导的p5 3,p16及p2 1对人肝细胞肝癌细胞系均有明显的促凋亡作用 ,体外凋亡率约 30 %左右 ,体内生长抑制率 30 %～ 4 4 % ;联合感染肝癌细胞效果更明显 ,体外凋亡率达 5 6 % ,体内癌生长抑制率 6 5 %。结论腺相关病毒介导的外源抑癌基因p5 3,p16和p2 1不仅对多种肝癌细胞系均有诱导凋亡和抑制生长作用 ,联合应用治疗肝癌更具有明显的相互协同作用。

白细胞介素10抑制枯否细胞诱导的肝星状细胞激活的研究

目的 研究白细胞介素 10 (IL 10 )对与枯否氏细胞 (KC)共培养的肝星状细胞 (HSC)激活的影响 ,并初步探讨其作用机制。方法 采用肝脏离体胶原酶灌注消化 ,及密度梯度离心的方法来分离培养HSC和KC ;将原代培养 2d的HSC和KC分为HSC单独培养、KC单独培养和HSC与KC共培养 3大组 ,分别加 2ng/ml和 2 0ng/ml的IL 10处理。 2d后 ,分别采用3 H 胸腺嘧啶脱氧核苷 (3 H TdR)掺入法检测HSC的增殖 ,Western印染法检测HSC中α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)的表达和酶联免疫吸附分析 (ELISA)法检测培养上清中肿瘤坏死因子 α(TNF α)的含量。结果 IL 10对单独培养的HSC的增殖 (P >0 .0 5 )和α SMA表达 (P >0 .0 5 )无明显影响。共培养组HSC的增殖和α SMA表达分别增加了 2 .4倍和 6倍 ;2ng/ml和 2 0ng/ml的IL 10分别使共培养组HSC的增殖降低了 2 3%和 33% ,α SMA表达降低了 35 %和 4 9% ,均呈浓度依赖性 ,和HSC单独培养组相比 ,差异有显著意义 (P <0 .0 5或P <0 .0 0 1)。HSC单独培养组未检测出TNF α ;共培养组的TNF α量比KC单独培养组增加了 74 %(P <0 .0 1) ;2ng/ml和 2 0ng/ml的IL 10分别使共培养组的TNF α量降低了 2 7% (P <0 0 1)和 36 % (P<0 0 1) ,使KC单独培养组的TNF α量降低了 2 9% (P <0 0 5 )和

肿瘤-睾丸抗原SSX1基因mRNA在肝细胞肝癌中的表达

目的 检测肿瘤 睾丸抗原SSX1基因mRNA在肝细胞肝癌 (HCC)中的表达情况。方法 用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对 47例HCC患者的癌组织和相应癌旁组织以及 1 5例肝硬化和 1 5例正常肝组织的SSX1基因mRNA表达情况进行检测 ,随机选择 4例RT PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。结果 47例HCC患者中 ,39例表达SSX1mRNA ,阳性率为83 % ,相应的癌旁组织中有 3例为弱阳性 ,其中 2例患者获得了离癌灶更远处的活检组织 ,对其进行RT PCR检测 ,结果显示阴性 ;所测的 1 5例肝硬化和 1 5例正常肝组织均未检测到SSX1的表达。4例DNA测序结果表明RT PCR产物确为SSX1cDNA。SSX1的表达与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、血清甲胎蛋白 (AFP)水平、乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)感染无显著相关性(P >0 .0 5)。结论 SSX1在HCC中呈高比例、高特异表达 。

组织胺及其1、2型受体阻断剂对贮脂细胞收缩的影响

目的 探讨组织胺及其 1型受体 (H1R)阻断剂、2型受体 (H2R)阻断剂对贮脂细胞收缩的影响。方法 采用肝脏离体胶原酶灌注消化及密度梯度离心的方法来分离培养贮脂细胞 ;用二甲基多聚硅烷烧制聚硅酮膜 ;传代后的贮脂细胞在聚硅酮膜上培养 3d后 ,随机分为 5组 :A组(对照组 ) ;B组 (组织胺 1× 10 -7mol/L组 ) ;C组 (组织胺 1× 10 -6mol/L组 ) ;D组 (H 1R阻断剂 +组织胺 1× 10 -6mol/L组 )和E组 (H2R阻断剂 +组织胺 1× 10 -6mol/L组 )。各组于加药前及加药后 2 0min摄相 ,在相片上分析同一视野细胞周围的聚硅酮膜皱纹变化 ,皱纹增多表明细胞收缩。结果 B组、C组的贮脂细胞收缩率分别为 2 1.0 %、34.2 % ,远高于A组的 3 .8% ,并呈量效依赖关系 (P <0 .0 0 1) ;D组的贮脂细胞收缩率为 17.7% ,低于C组 (P <0 .0 5 ) ;E组的贮脂细胞收缩率为2 6 .3 % ,与C组相比 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 组织胺通过H1R的介导促进贮脂细胞的收缩 。

肝癌特异性p53基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建一种肝癌细胞靶向性的腺相关病毒载体以用于肝癌的促凋亡基因治疗的研究。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物 ,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白 (α fe toprotein ,AFP)启动子序列并克隆到真核表达载体pTR UF5上 ;再通过平端连接的方法 ,构建成含甲胎蛋白启动子和人野生型p5 3基因的重组腺相关病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)质粒rAAV AFP 5 3和绿色荧光蛋白基因GFP(greenfluorescenceprotein)的质粒rAAV AFP GFP。结果 成功地构建了以腺相关病毒为载体、受人甲胎蛋白启动子调控表达人野生型p5 3基因的质粒系统。结论从理论上说 ,我们构建的重组腺相关病毒质粒rAAV AFP p5 3,可以特异性地转染到肝癌细胞中 。

γ干扰素刺激肝细胞癌细胞表达共刺激分子和主要组织相容性复合物的研究

目的 研究共刺激分子 (CD80和CD86)和主要组织相容性复合物 (MHC)在肝细胞癌 (HCC)细胞中的表达 ,探讨γ干扰素 (γ INF)治疗HCC中的免疫作用机理。方法 应用流式细胞仪测定CD80、CD86和MHCⅡ类分子HLA DR ,以及应用微量细胞毒方法测定MHCⅠ类分子在γ INF刺激前后 8种HCC细胞中的表达。结果 所有未受刺激的HCC细胞的CD80、CD86和HLA DR表达率均不超过 3 .5 8% ,只在 3种细胞中测到MHCⅠ类分子的表达 ;γ INF以 10 6U /L的浓度刺激 48h后 ,所有 8种HCC细胞HLA DR表达率均升高 ,其中 7种升高至 18%以上 ,5种升高至 70 %以上 ,荧光强度增强 10～ 5 0倍 ;刺激后 ,在 8种细胞中均可测到MHCⅠ类分子表达 ;刺激后 ,所有 8种HCC细胞CD86表达率均升高 ,7种升高至 12 .3 5 %～ 17.10 % ,5种HCC细胞CD80表达率升高至 5 %～ 10 %。结论 γ INF刺激可使多数被研究的HCC细胞获得一定的抗原呈递能力 ,同时可使所有被研究的HCC细胞获得被细胞毒T淋巴细胞识别和杀伤的条件。

甲胎蛋白启动子调控表达p53基因的肝癌细胞靶向性基因治疗载体的研究

目的 利用含有人甲胎蛋白启动子的腺相关病毒载体 ,构建能在人肝癌细胞株中特异表达目的基因的质粒。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物 ,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白启动子 (AFPpromoter)序列并克隆到含有绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因的质粒pTR UF5上 ,构建成含报告基因的重组腺相关病毒质粒rAAV AFP GFP ;再通过平端连接的方法 ,构建成含p5 3基因的质粒rAAV AFP 5 3。通过用rAAV AFP GFP转染表达AFP的HepG2 细胞株和不表达AFP的 2 93细胞株 ,以检测AFP启动子的功能。rAAV AFP 5 3转染HLE肝癌细胞株后 ,用流式细胞分析检测对细胞周期的影响。结果 rAAV AFP GFP和经测序、酶切鉴定证实为含有人AFP启动子的质粒。细胞转染表明rAAV AFP GFP能特异地在AFP阳性细胞中高效表达目的基因 (质粒转染效率为 36 .5 % ) ;rAAV AFP 5 3使HLE的凋亡率达到 73 .88%。结论 成功构建了以腺相关病毒为载体、受人AFP启动子调控表达人野生型p5 3基因和报告基因的质粒。