siRNA干扰HSV1 gD糖蛋白基因的研究

以HSV1 gD糖蛋白基因为靶点,设计合成5对siRNA,并构建pEGFP-N1-gD融合表达质粒,脂质体法共转染Vero细胞,利用绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征,流式细胞仪筛选特异沉默gD表达的siRNA。然后有效siRNA转染Vero细胞并感染HSV1,通过空斑减数实验,Real-time PCR和子代病毒滴度评价其对HSV-1感染的作用。结果显示siRNA能有效抑制gD-EGFP融合蛋白和感染细胞内gD糖蛋白的表达,但对HSV-1的感染性无明显抑制作用,故选择gD作为siRNA抗病毒靶点还需进一步的论证。

单纯疱疹病毒1型US12基因siRNA筛选及其对病毒增殖的影响

目的:筛选高效沉默单纯疱疹病毒1型(HSV-1)US12基因的siRNA,研究siRNA沉默US12基因后对HSV-1增殖的影响。方法:构建pEGFP-N1-US12融合表达质粒,设计并化学合成3对靶向US12基因的siRNA,与pEGFP-N1-US12融合表达质粒共转染Vero细胞,流式细胞术筛选高效抑制pEGFP-N1-US12融合蛋白的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA对细胞内US12 mRNA表达水平的抑制效果,空斑减数实验评价siRNA对HSV-1增殖的抑制效果。结果:共转染实验筛选出高效抑制pEGFP-N1-US12融合蛋白的siR-NAS121、siRNAS122及siRNAS123。3对siRNA均能显著降低感染细胞US12 mRNA的表达水平,但空斑减数实验均未发现3对siRNA对HSV-1的增殖有显著抑制效果。结论:成功构建pEGFP-N1-US12融合表达质粒,筛选到高效抑制US12基因表达的3对siRNA,但是对病毒的体外增殖无显著影响,表明US12表达的立即早期蛋白ICP47的功能可能与HSV-1体外增殖无直接相关。

人HSV-1 UL40基因重组质粒的构建及其在siRNA筛选中的应用

目的:快速筛选出高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA,为进一步应用RNA干扰的相关研究奠定基础。方法:应用RT-PCR扩增人HSV-1F株UL40基因,将其连接到pEGFP-N1构建pEGFP-N1-UL40融合蛋白表达质粒。将化学合成的针对UL40基因的siRNA与重组质粒共转染Vero细胞,通过观察绿色荧光蛋白报告基因的表达筛选高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。结果:倒置荧光显微镜观察发现设计的4对siRNA中siRNA3和siRNA4能明显降低绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测证明siRNA3和siRNA4对目的基因沉默效率分别达到76.99%和84.00%。结论:成功构建了人HSV-1 UL40基因融合表达载体pEGFP-N1-UL40,并利用该载体筛选出2对高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。

HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的:克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法:从感染HSV-1F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30 cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30 cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1形成pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果:成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1F株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论:成功克隆出UL30 cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。

siRNA干扰HSV-1 UL30 DNA聚合酶基因的研究

目的:筛选高效沉默HSV-1UL30基因的siRNA,研究siRNA沉默UL30基因后对HSV-1繁殖的影响。方法:设计并化学合成12对靶向UL30基因的siRNA,与pEGFP-N1-Fi融合表达质粒共转染VERO细胞,流式细胞术筛选高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA对感染细胞内UL30mRNA表达的抑制效果,CPE法和空斑减数实验评价siRNA对HSV-1繁殖的抑制效果。结果:共转染实验筛选出高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA4、siRNA10及siRNA8,这3对siRNA均能显著降低感染细胞内UL30mRNA的表达水平及病变细胞释放到培养上清的子代病毒滴度,siRNA4和siRNA10在感染后36h对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,其病斑分别比对照组减少61.17%、51.46%(P<0.05),siRNA4、siRNA10及siRNA8组最终形成的空斑直径分别比对照组减小29.94%、23.49%、21.69%(P<0.01)。结论:筛选到高效抑制UL30的3对siRNAs,siRNA4及siRNA10在病斑形成早期对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,说明siRNA4、siRNA10及siRNA8均能延缓病斑的扩大和病斑数目的增长,对病毒的繁殖有一定的抑制效果。

微小RNA-21反义寡核苷酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用

目的探讨微小RNA-21(miR-21)反义寡核苷酸(miR-21ASO)对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用。方法通过转染miR-21ASO,采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测舌鳞癌细胞株SCC-15和CAL27中miR-21的表达变化,荧光素酶活性检测实验分析miR-21ASO在舌鳞癌细胞中的调控功能,并运用多种细胞增殖和凋亡检测方法以观察miR-21ASO对舌鳞癌细胞调控产生的系列效应。结果miR-21在两株舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27中的表达显著高于在正常舌鳞状上皮细胞中的表达(P=0.037,0.015),转染miR-21ASO可显著抑制其表达(P=0.017,0.006),miR-21对荧光素酶活性的抑制率由50%显著减少到20%以下(P=0.002,0.003),SCC-15和CAL27细胞存活率比转染前明显降低(P=0.002,0.004),细胞克隆形成率比转染前明显降低(P=0.007,0.032);流式细胞仪检测显示转染miR-21ASO后,SCC-15和CAL27细胞凋亡明显增加,激光共聚焦显微镜观察到线粒体细胞色素C释放较转染前增加。结论miR-21ASO对舌鳞癌细胞miR-21水平降低具有靶向特异性,转染miR-21ASO可有效抑制miR-21的促癌效应,利用反义核酸技术的高度特异性开展针对促癌microRNA分子的靶向治疗将可能为舌鳞癌的基因治疗开辟新的途径。