Fas胞外区基因的构建、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建Fas胞外区(eFas)基因的表达载体,表达纯化重组蛋白,进行多克隆抗体的制备,为进一步功能研究奠定基础。方法通过重叠PCR获得eFas基因的编码序列,构建pET-22b(+)/eFas表达载体,转化大肠杆菌Rosetta-gami,IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。将纯化的eFas融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法检测多克隆抗体的效价。结果获得了eFas的编码序列与表达载体,目的蛋白主要在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。结论eFas融合蛋白基因的构建、表达、纯化以及多克隆抗体的制备,为进一步研究Fas提供了材料。

抗人死亡受体5单链抗体的构建表达纯化及活性分析

目的构建、表达、纯化抗人死亡受体5(DR5)单链抗体,并检测其诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法采用RT-PCR获取鼠源性抗人DR5单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列,以一柔性连接肽连接二者,转入表达载体,以大肠杆菌表达融合蛋白,亲和色谱纯化后用MTT实验和凋亡检测试剂盒检测其凋亡诱导活性。结果获得的序列经比对为抗体重链和轻链可变区基因,表达纯化后的重组蛋白具有接近完整抗体的肿瘤细胞凋亡诱导活性。结论抗人DR5 scFv可作为诱导肿瘤细胞凋亡的候选药物,为肿瘤免疫学研究提供材料。

抗人死亡受体5单链抗体特性分析

目的探究抗人死亡受体5(DR5)单链抗体(aDR5ScFv)的特异性。方法 ELISA检测aDR5ScFv的效价、亲和力和表位分析。Western blotting检测单链抗体的特异性。MTT检测aDR5ScFv对结肠癌细胞SW480的生长抑制。结果 ELISA显示抗人死亡受体5单链抗体抗体效价为1.2×104。通过间接ELISA证实aDR5ScFv与aDR5mAb识别DR5胞外段(eDR5,系本实验室自己构建)的同一个位点。aDR5ScFv的亲和力常数为2.12×10-2。eDR5与aDR5ScFv能够特异结合。MTT检测结果显示,aDR5ScFv抑制SW480细胞生长呈剂量依赖性,aDR5ScFv终质量浓度分别为0.225 mg/ml、0.45 mg/ml、0.9 mg/ml、1.2 mg/ml。200μl时,SW480细胞的存活率分别为97.7%,70.9%、70.1%、23.6%。结论 aDR5ScFv能与eDR5特异性结合,并有较强的活性。

抗人DR5单链抗体诱导HepG2细胞凋亡的实验研究

目的探究抗人DR5单链抗体(scFv)ZF1对肝癌细胞株HepG-2的凋亡作用及机制。方法 MTT法检测ZF1对HepG-2的细胞毒效应;流式细胞术检测ZF1诱导HepG2的凋亡率;荧光显微镜观察经ANNEXIN-V/PI双染的HepG-2细胞;DNA Ladder检测HepG-2细胞的DNA特点;Western blotting检测Bcl-2、PARP蛋白的表达。结果 MTT结果显示ZF1抑制HepG-2细胞生长呈剂量依赖性,ZF1终浓度分别为0.225、0.45、0.9mg/ml、1.2mg/ml200μl时,HepG-2细胞的生长抑制率分别为28.8%、52.3%、65.3%、89.8%;流式细胞仪检测结果显示,终浓度分别为0.225、0.45、1.2mg/ml2ml作用HepG-2细胞4h,凋亡率分别为32.9%、56%、83.2%;荧光显微镜下可见早期凋亡细胞,细胞膜呈绿色荧光,细胞内有凋亡小体的形成,伴有核结构的变化;DNALadder出现明显的彗星尾状条带;Western blotting检测到ZF1诱导凋亡的细胞内Bcl-2、PARP蛋白表达上调。结论 ZF1可诱导HepG2细胞株凋亡,这种作用与HepG2细胞株表达Bcl-2、PARP蛋白蛋白表达上调相关。

抗人死亡受体5单链抗体ZF1对鼠H22肝癌细胞的作用分析

目的:研究抗人死亡受体5单链抗体ZF1对H22肝癌细胞体内外抑制增殖作用。方法:MTT法检测ZF1对H22肝癌细胞体外杀伤作用,流式细胞术检测ZF1诱导H22的凋亡率,建立H22移植瘤模型,随机分为PBS组、ZF1组、EPI组和ZF1/EPI联合组四组。观察肿瘤生长和小鼠体重变化情况。治疗13天后分离肿瘤组织,进行HE染色检查、TUNNEL法检测细胞凋亡。结果:体外实验显示:ZF1可抑制H22细胞的增殖,呈剂量依赖性,抑制率最高为84.5%。体内实验结果显示单独应用ZF1或联合应用ZF1/EPI时,肿瘤增长受到明显抑制。HE染色和TUNNEL分析结果表明ZF1可有效诱导肝癌肿瘤凋亡,ZF1/EPI联合组效果更明显,而对正常肝细胞无毒性。结论:单链抗体ZF1具有良好抑制H22细胞增殖的作用。ZF1和EPI联合应用效果更明显。

Anti-DR5 mAb诱导佐剂型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡及机理初探

目的:探讨Anti-DR5 mAb诱导佐剂型关节炎(Adjuvant Arthritis,AA)大鼠滑膜细胞凋亡作用及其可能机理。方法:注射弗氏完全佐剂建立AA大鼠模型,分离并体外培养大鼠滑膜细胞。MTT检测、DNA倍体分析及流式细胞术分析Anti-DR5 mAb对大鼠滑膜细胞的凋亡作用,Western blot检测大鼠滑膜细胞Caspase-3、Bcl-2蛋白的表达,Caspase抑制剂实验分析Anti-DR5 mAb对大鼠滑膜细胞凋亡作用的机制。结果:MTT实验表明Anti-DR5 mAb能抑制大鼠滑膜细胞的增殖,流式细胞术分析这种作用模式为细胞凋亡。Anti-DR5 mAb处理后的大鼠滑膜细胞中Caspase-3蛋白水平上升,Bcl-2蛋白水平下调。Cas-pase抑制剂实验证明Anti-DR5 mAb诱导大鼠滑膜细胞的凋亡是通过Caspase途径实现的。结论:Anti-DR5 mAb诱导大鼠滑膜细胞的凋亡,这种作用与滑膜细胞表面Caspase-3、Bcl-2蛋白表达相关。

人死亡受体5全长基因的构建及转染胶质瘤细胞

目的构建人死亡受体5(death receptor5,DR5)全长基因真核细胞表达载体pcDNA3.1/DR5,pcDNA3.1/GFP/DR5,并观察其转染胶质瘤细胞U138的效果。方法通过重叠PCR获得DR5全长编码序列,构建pcDNA3.1/GFP/DR5,pcDNA3.1/DR5表达载体,利用脂质体转染试剂盒,分别将2种质粒pcDNA3.1/GFP/DR5、pcDNA3.1/GFP共转染胶质瘤细胞U138,转染后72h,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DR5mRNA的表达,流式细胞术检测DR5的表达强度、检测Anti-DR5对胶质瘤细胞U138生长的影响。结果获得了DR5全长编码序列,成功瞬时转染U138,RT-PCR、流式细胞术检测结果表明,转染后U138细胞DR5mRNA、蛋白水平的表达明显增加,Anti-DR5可以明显抑制U138细胞的生长。结论获得了DR5全长编码序列,探索到成功转染DR5的最佳方法,为稳定筛选高表达DR5的U138细胞提供依据。