蓝舌病毒核酸杂交技术的研究

核酸杂交技术的出现为蓝舌病(BT)的诊断开拓了一个新纪元,它是检测蓝舌病毒(BTV)既快速又敏感的方法。本技术不依赖于病毒分离与鉴定,而是直接检测蓝舌病毒的基因片段,具有很高的特异性。我们应用〔γ^(-32)p〕ATP末端标记BTV全基因组,进行打点杂交和Northern印渍转移杂交,以期建立BTV的核酸杂交诊断技术。本试验结果令人满意。

蓝舌病毒核酸末端标记方法的研究

应用[γ—^(23)P]ATP对蓝舌病毒核酸进行末端标记,结果表明3’末端标记制备的探针的放射比强度明显高于5’末端标记,而5’末端脱磷后再标记的结果同样较为理想。应用3’末端标记法或5’末端标记法皆能获得高放射比强度的核酸探针,完全满足于核酸试验。

用斑点酶联免疫吸附试验测定蓝舌病抗体的研究

蓝舌病病毒(BTV)是具有多片段的双股RNA病毒,它是呼肠孤病毒科环状病毒属的代表毒株。迄今为止,已发现本病毒至少有24个血清型,并广泛流行于世界各国,对畜牧业的危害极大。本病的常规诊断方法是琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)。近年来不少学者又应用多克隆抗体和单克隆抗体先后建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)

快速碱印渍转移RNA技术的建立

Joseph,K.K.Li等(1987)首先建立并应用快速碱转移RNA技术对蓝舌病毒(BTV)核酸进行了研究,证明该技术转移效率高,操作简单,不需要昂贵仪器,并且发现不同类型的膜对于实验的重复性影响极大。我们根据Joseph,

生物素——亲和素双抗原夹心斑点酶联免疫吸附试验检测动物蓝舌病抗体的研究

测定蓝舌病(BT)群特异性抗体最常用的血清学方法是琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID),为了提高反应的灵敏度和特异性,1980年以来国内外学者们又发展了ELISA间接法和阻断法。因聚苯乙烯板对蓝舌病抗原的吸附较差,板间差异较大,而且结果判断需要专用仪器等。

多种鸡病血清抗体效价联合测定法的研究

酶联免疫吸附试验(ELISA)做为一种简便、快速、灵敏、特异的诊断方法在兽医界已得到广泛的应用。在此基础上,一些学者又建立了P/N—ET和OD-ET法,这种方法的特点在于将免疫学和统计学有机地结合起来,对血清抗体效价进行测定时,只要将血清样品做一个稀释度进行ELISA,测出结果(P/N或OD值)

蓝舌病琼脂凝胶免疫扩散试验改良法和标准法的比较

测定动物体内蓝舌病群特异性抗体的方法有补体结合试验,酶联免疫吸附试验,琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)等。其中以AGID最为简便、快速和经济。自从1962年Klonts等人报道用AGID测定蓝舌病抗体以来,很多学者又先后作了改进。目前,世界各国均以Joehim(美国兽医诊断者协会蓝舌病委员会主席)和Pearson等建立的AGID为标准程序来检测蓝舌病抗体。

西藏牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离和鉴定

从西藏牦牛体内分离到了一株能使犊牛睾丸细胞产生明显病变的牛病毒性腹泻/粘膜病病毒,该分离物能使西藏牦牛和山东黄牛出现类似的临床症状,其中以牦牛的症状更接近于自然感染病例。电镜下可看到分离物为球形有囊颗粒、直径约为65nm;对酸、热和乙醚敏感,对5—碘脱氧脲苷有抵抗力;将病变细胞用吖啶橙染色后能见到橙红色荧光;通过琼脂凝胶免疫扩散试验和细胞中和试验,均证明分离毒与BVD毒具有共同的抗原性,它们的抗体也具有共同的抗原结合位点。上述结果充分证明西藏牦牛分离毒为牛病毒性腹泻/粘膜病病毒,它将为西藏地区控制和预防本病流行提供有力的依据。

应用DIG标记探针杂交检测IBDV

本试验用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ＤＩＧ）标记的探针建立了核酸杂交检测传染性法氏囊病病毒（ＩＢ－ＤＶ）的方法，并在敏感性方面同琼脂扩散试验进行了比较。探针来源于ＩＢＤＶＳＴＣ－ｌｌ９和ＳＴＣ－２４３ｃＤＮＡ。杂交方法的敏感性试验表明，核酸杂交可以检测到０．１ｐｇ的ＩＢＤＶＲＮＡ；与多个毒株核酸的杂交则显示出标记的探针可以作为通用试剂用于ＩＢＤＶ早期感染的诊断；而同琼脂扩散试验的比较则说明，杂交方法比常规的免疫沉淀反应敏感１０４倍以上。除此之外，由于杂交方法特异以及非放射性探针操作方便，因而具有很大的应用前景。

传染性法氏囊病病毒cDNA文库的构建

本试验利用随机引物法反转录鸡传染性法氏囊病病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉ－ｒｕｓ，ＩＢＤｖ）的双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），并构建了ｃＤＮＡ文库。病毒为青岛株，来自感染鸡的法氏羹。用免疫复合物沉淀法提纯病毒，抽提核酸，经琼脂糖凝胶电泳纯化。ＩＢＤＶｄｓＲＮＡ经反转录、加ｐｏｌｙ（ｄｃ）后，克隆于加有ｐｏｌｙ（ｄＧ）的线性化质粒ｐＴ／３α－１９上，并转化大肠杆菌ＤＨ５αＦ′，结果筛选出１１６个含有外源片段（长度为０．３－１ｋｂ，平均０．６ｋｂ）的克隆，经鉴定外源片段均为ＩＢＤＶｃＤＮＡ。

用聚合酶链反应检测产蛋下降综合症病毒核酸的研究

根据对ＥＤＳ一ＤＮＡ重组质粒ｐＴＥＺ.Ｐ３和ｐＴＥＺ．Ｐ２８的核酸序列分析结果，设计了两对引物，它们均能从ＥＤＳ一ＤＮＡ上扩增出一个特异片段，其长度分别为２３８ｂｐ和２０９ｂｐ。经比较，ＰＣＲ比血球凝集试验至少灵敏２００倍，比核酸杂交试验灵敏千万倍；对１００份自然发病鸡的肛拭子、血液和软壳蛋等样品的检测结果表明：ＰＣＲ的阳性检出率远高于核酸杂交试验，并用病毒分离方法证实了ＰＣＲ对野外病料的检出结果是可信的，对常规的ＰＣＲ条件还作了改进，使试剂的用量减少了１０倍以上，并简化了一些烦琐操作。

传染性法氏囊病病毒分子生物学研究进展

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disense virus,IBDV)是引起鸡的最严重的传染病之一,给养鸡业造成了巨大的经济损失,其危害除了直接引起临床症状外,更为重要的是破坏机体的免疫器官,主要是破坏B淋巴细胞前体,引起严重的免疫抑制,使鸡对其他病原的免疫力丧失,结果导致死亡。 IBDV最初被认为是呼肠孤病毒科的成员。

用生物素化重组质粒探针检测产蛋下降综合症病毒核酸

用ＥＤＳ－７６标准毒株感染鸭胚后，提取病毒核酸，经ＰｓｔＩ酶切后，与质粒ｐＴ７／Ｔ３α－１９重组，并转化到大肠杆菌ＤＨ５α中，筛选出一个插入片段为３１８ｂｐ的重组质粒，并命名为ｐＴＥＺ．Ｐ３。用生物素标记该重组质粒后，分别对正常鸭胚尿囊液、各地分离的ＥＤＳ毒株和禽类易感的几种病毒进行核酸杂交试验，结果该探针对实验中收到的几种ＥＤＳ分离毒均产生阳性反应，而不与正常鸭胚尿囊液和其它几种禽类病毒杂交；该探针还可从被感染鸡的软壳蛋和肛拭子中检测到病毒。在本研究中，对常规的核酸杂交试验中的样品处理、预杂交及洗涤等程序也作了改进。从采样开始，在两天之内就能得到结果。所以它是一种比病毒分离工作更为简便、快速和经济的方法。探针的标记用生物素代替同位素，也使本方法易于在基层单位推广应用。

用多聚酶链反应检测非洲猪瘟病毒的研究

用HindⅢ对非洲猪瘟病毒核酸的重组质粒pRPEL2进行酶切后,将第5片段插入到pT7/T3α-19上而得到亚克隆重组质粒pT7 ASFH5。用双脱氧末端终止法测定了该插入片段的核苷酸序列。在此基础上选择了一段含194bp的片段作为扩增模板,并人工合成了该片段两端含20个碱基的寡核苷酸作为引物,从而建立了诊断非洲猪瘟病毒的多聚酶链反应。与核酸杂交相比,该方法不但更为快速和简便,而且灵敏度提高了一千万倍左右.

用多聚酶链反应检测非洲猪瘟病毒的研究

用ＨｉｎｄⅢ对非洲猪瘟病毒核酸的重组质粒ＰＲＰＥＬ２进行酶切片，将第五片段插入到ＰＴ７／Ｔ３α－１９上而得到亚克隆重组质粒ＰＴ７ＡＳＦＨ５。用双脱氧末 端终止法测定了该插入片段的核苷酸序列。在此基础上选择了一段含１９４ｂｐ的片段作为扩增模板，并人工合成了该片段两端含２０个碱基的寡核苷酸作为引物，从而建立了诊断非洲猪瘟病毒的多聚酸链反应。与核酸杂交相比，该方法不但晚为快速和简便。

2号染色体父系单亲二倍体遗传亲子鉴定1例

夫妻二人因女儿移民,要求进行亲子鉴定,以确定他们之间的亲生关系。1.2检验过程采集三人的指血到无菌滤纸上。先用人类STRtyper-21G扩增荧光检测试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司)进行D3S1358等20个基因座检测,发现女儿与母亲之间在TPOX和D2S1338基因座上不符合孟德尔遗传规律,按照司法部颁布的《亲权鉴定技术规范》(SF/Z JD0105001-2016)的方法计算这些基因座的父权指数(paternity index,PI),累积父权指数为1.561 5×102,需增加检测基因座来达到判断要求。

减蛋综合征病毒核酸序列分析及基因扩增研究

从被ＥＤＳ－７６病毒感染的鸭胚尿囊液中提取病毒核酸，经ＰｓｔⅠ酶切后重组到ｐＴ７／Ｔ３α－１９的ＰｓｔⅠ位点，再转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中。在ＬＢ平板上筛选了一个ＥＤＳ－７６特异的ｐＴＥＺ·Ｐ２８重组质粒。用双脱氧末端终止法测定了该重组质粒中插入片段的一段核酸序列。在此基础上设计了一对引物，用这对引物成功地从ＥＤＳ－７６ＤＮＡ上扩增出了一个２０９ｂｐ的核酸片段。

鸡减蛋综合症病毒DNA片段的克隆及生物素化探针的制备

用EDS-76病毒感染鸭胚,从尿囊液中提取EDS-76病毒DNA。用EcoR I和Sall双酶切后与质粒pT7/T3a-19重组,并转化到大肠杆菌DH_5α中。提取重组质粒,经双酶切后进行电泳分析表明,至少已得到了五种片段的克隆。将其中插入片段约为0.4Kb的重组质粒经光敏生物素标记后作为探针检测EDS-76感染的鸭胚尿囊液提取物,证实了该探针对EDS-76 DNA具有特异性,而且至少可检出1pg的EDS-76 DNA。

西藏牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离和鉴定

1976年以来,在我国西藏昌都地区一带的牦牛群中流行一种类似于病毒性腹泻/粘膜病的传染病,其主要临床症状为急性腹泻,体温升高,口鼻腔溃烂、流涎,眼结膜充血、流泪,孕母牛流产等,并常引起母牛和小牛死亡。1988年8月在西藏类乌齐县和巴青县一带又爆发本病,我们赴现场采集病料,并进行动物的回归试验以及病毒的分离与鉴定工作。

产蛋下降综合症病毒(EDS’76)核酸序列分析及基因扩增研究

从被EDS＇76病毒感染的鸭胚尿囊液中提取病毒核酸,经Pstl酶切后重组到PT_7/T_3a—19的PstI位点,再转化到Ecoli DH 5a中。在LB平板上筛选了一个EDS特异的PTEZ·P28重组质粒。用双脱氧末端终止法测定了该重组质粒中插入片段的一段核酸序列,在此基础上设计了一对引物,用这对引物成功地从EDS＇76—DNA上扩增出了一个209 bP的核酸片段。