八味中草药对维氏气单胞菌TH0426生物膜形成的影响

为了解中药对维氏气单胞菌(Aerornomas veronii,AV)TH0426株生物膜形成的影响。采用微孔板半定量法,研究五倍子、红花、黄连、鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴及黄芩8味中药水煎液对AV TH0426株生物膜的影响。结果显示,低浓度五倍子、红花和黄连水煎液对菌株生长及生物膜形成均无明显影响;而高浓度五倍子和黄连水煎液可通过抑制菌株的生长来影响生物膜的形成,高浓度红花水煎液对生物膜抑制作用明显,且不影响菌株的正常生长;其余五味中药鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴和黄芩对菌株的生长及生物膜形成无明显影响。表明高浓度五倍子、红花及黄连水煎液能抑制AV TH0426株生物膜的形成,具有抗AV TH0426株生物膜的作用,这将为从抗生物膜角度防治维氏气单胞菌提供有益参考。

维氏气单胞菌灭活疫苗的制备及对锦鲤免疫效果评价

为证明维氏气单胞菌灭活疫苗对锦鲤机体的免疫效果,应用福尔马林灭活法制备了维氏气单胞菌灭活疫苗对免疫后的锦鲤进行酸性磷酸酶活力检测、超氧化物歧化酶活力检测、吞噬活力等各项免疫指标的检测,并于试验第5周进行免疫保护力试验。结果显示,酸性磷酸酶活力在试验开始后有所上升,在第2周达到最高;超氧化物歧化酶活力上升,并在第2周达到最高;经观察,第3周开始白细胞的数量增多,吞噬活性同时增大;抗体效价于第3周达到最大值,并持续一段时间;免疫4周后攻菌检测免疫保护力,测得试验组的相对免疫保护率RPS为86.4%。上述结果表明,维氏气单胞菌灭活疫苗能够诱导锦鲤机体产生免疫应答反应,并能形成一定保护力。

一株鱼源植物乳杆菌的部分生物学特性研究

为了从实验室现有的3株乳酸菌中筛选出对维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌抑菌效果较好的乳酸菌,并对其部分生物学特性进行研究,试验采用打孔方法从3株菌中筛选出抑菌效果较好的菌株,并对该菌株在不同胆盐浓度、不同pH值、高温环境下的生长情况以及对胰蛋白酶的耐受能力和生长能力进行测定。结果表明：3株乳酸菌中,仅植物乳杆菌C20015对致病菌均有抑制作用,其余两株菌对其无抑制作用;C20015在抗逆性试验中,随胆盐浓度的增加,其活菌数下降,但活菌数均达到1.0×10^5cfu/mL以上;在pH值为2时,C20015的活菌数明显下降,当pH值大于3时,活菌数均达到1.0×10^6cfu/mL以上;在耐高温试验中,50℃时C20015活菌数下降不明显,但60℃以上几乎无菌生长;胰蛋白酶对活菌数无影响;植物乳杆菌C20015在0-10 h内快速增长,从10小时开始进入生长稳定期,直到20小时细菌数达到最大值3.6×10^9cfu/mL。说明植物乳杆菌C20015对水产类致病菌有一定的抑制作用,且对低pH值、高浓度胆盐、胃蛋白酶具有一定的耐受能力,有望应用于水产养殖饲料。

蓝曼龙鱼致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与系统进化分析

从患病蓝曼龙鱼(Trichogaster trichopterus)体内分离到1株细菌CC0323,经人工感染试验对蓝曼龙鱼有一定致病力。采用形态学观察,生理生化鉴定,16S r RNA序列分析,构建系统发育树等方法进行鉴定。结果分离株CC0323为革兰阴性短杆菌,具多形性,在RS琼脂上可生长,呈中等大小,表面光滑的淡黄色湿润菌落;理化特性和药敏试验结果与维氏气单胞菌基本相同;系统发育树可见CC0323与维氏气单胞菌QXL0711B进化关系最近。试验结果,证明分离株CC0323为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。

青虾源维氏气单胞菌胞外产物生物学特性及蛋白成分分析

为了研究维氏气单胞菌胞外产物在青虾感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理,本试验以青虾源维氏气单胞菌QXF0711B为研究对象,提取其胞外产物,采用打孔法测定其胞外产物的酶活性,并对溶血活性进行溶血谱分析,同时分析其致病性。应用液相质谱与串联质谱相结合方法(LC-MSMS)对其胞外产物蛋白成分进行鉴定,利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明:QXF0711B菌株胞外产物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性,不具有明胶酶活性;其可溶解多种动物红细胞,尤以对鱼类红细胞溶血性更强,但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。通过对菌株胞外产物蛋白成分分析显示有90种蛋白:共参与45种生物学过程,主要涉及碳水化合物代谢过程、运输等;共有46种分子功能,主要涉及DNA结合、ATP结合、金属离子结合等;为12种细胞组分,主要包括膜的有机组成、细胞质、细胞外膜等。

长春市售乌鳢携带嗜水气单胞菌情况调查

为探讨乌鳢体内嗜水气单胞菌携带情况,本调查以长春市售表观健康乌鳢为研究材料,从其体内分离并鉴定嗜水气单胞菌,并对分离株携带毒力基因情况进行调查,同时选取代表株进行致病性试验。结果显示:共分离嗜水气单胞菌107株,其中56%以上分离株携带3种以上毒力基因,88.79%(95/107)的分离株携带Lux S基因;致病性试验结果显示,携带毒力基因菌株对小鼠、斑马鱼均有一定致病性,随着菌株携带毒力基因种类的增多,致病力也相应增强。研究结果对研发食用乌鳢的公共卫生安全具有一定意义。

细鳞鱼杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离鉴定

为确定吉林省某渔场细鳞鱼发病死亡的病因,本研究由濒死的细鳞鱼体内分离出一株优势菌,经动物回归试验,该菌株对细鳞鱼具有致病性,将其命名为BRL-15。经菌体、菌落形态,理化特性,16S rRNA基因序列分析,鉴定菌株BRL-15为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。药敏试验结果显示,该菌株对所选抗菌药物中绝大多数高度敏感。试验结果为细鳞鱼杀鲑气单胞菌病的防治提供一定理论依据。

1株人兽鱼共患病原菌嗜水气单胞菌的分离鉴定

为了对长春市某养鱼场病死鱼致病菌进行分离鉴定,对分离菌株进行了生物学特性分析,16S rRNA和3种管家基因的序列测定与分析,并对其进行鲤鱼、昆明系小鼠致病性试验及药敏试验。结果显示,该细菌为革兰阴性杆菌,培养特性、理化反应与嗜水气单胞菌基本相同;对左氧氟沙星、卡那霉素等18种抗菌药物敏感,万古霉素、苯唑西林等4种抗菌药物耐药;16S rRNA和dnaJ、rpoD、gyrB管家基因的均与Gen Bank上的嗜水气单胞菌相应基因有较高的同源性,同源性最高分别为99.6%、97.9%、99.9%。分离菌株对鲤鱼、昆明系小鼠有较强的致病作用,其半数致死量分别为6.76×10-7CFU/只、1.39×10-6CFU/只,表明该菌可能是1株人兽鱼共患病原菌。

乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物的生物学活性分析

为研究维氏气单胞菌胞外产物在乌鳢感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理,以乌鳢源维氏气单胞菌WL161为研究对象,提取其胞外产物,采用打孔法测定其胞外产物的酶活性,并对与毒力密切相关的溶血活性进行进一步的溶血谱研究,同时分析其致病性。应用LCMSMS方法对其胞外产物蛋白成分进行鉴定,利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明,WL161菌株具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性,不具有明胶酶活性;ECP对其他多种动物红细胞均有溶血活性,对鱼类红细胞溶血性较强,但对鸡红细胞无溶血活性。其胞外产物共检测出118种蛋白,共参与40种生物学过程,主要涉及碳水化合物代谢过程、几丁质分解代谢过程、DNA结合等;69种分子功能主要涉及ATP结合、金属离子结合、碳水化合物结合等;19种细胞组分主要包括胞外区、细胞质、细胞外膜等。

鸡腿蘑速冻工艺及质量控制

速冻鸡腿蘑是一种新型鸡腿蘑保鲜方法,介绍了速冻鸡腿蘑的生产工艺,并对影响产品质量的因素进行分析,提出了一些有效的质量控制措施。

锦鲫致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定长春市某水产养殖场发病锦鲫(Brocaded crucian)病原菌,本研究从患病锦鲫体内分离得到一株优势菌株,并对其进行了常规理化特性、分子生物学、人工感染试验及药敏检测。结果显示:分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,其理化特性与维氏气单胞菌(A.veronii)特征相符,并且其16S r DNA基因、gyr B基因、dna J基因、rpo D基因与Gen Bank中A.veronii相应基因序列的同源性均高达99%,在系统进化树中与A.veronii聚为一族,将其命名为JLND-1611;人工感染试验结果显示,锦鲫感染7 d后全部死亡,临床症状与自然病例相似,而且对斑马鱼LD_(50)为1.51×10^(2.67)cfu/m L;毒力基因检测显示,从JLND-1611可以扩增出6种毒力因子:脂肪酶(lip)、核酸酶(exu)、密度感应系统调控基因(luxs)、粘附素(aha)、气溶素(aer)及氨酸蛋白酶(ser);综合检测结果表明该分离株为致病性A.veronii。药敏试验结果显示,分离株对19种抗菌药物中头孢曲松、头孢哌酮及多西环素等药物敏感。本研究为锦鲫感染A.veronii的鉴定及治疗药物的选取提供了参考依据。

中草药水提物对黄颡鱼源维氏气单胞菌的体外抑菌活性研究

为了研究中草药对黄颡鱼源维氏气单胞菌的体外抑菌活性,试验通过水提法提取80种中草药有效成分,采用琼脂平板扩散法和试管二倍稀释法测定80种中草药水提物对维氏气单胞菌TH0426的体外抑菌活性,并研究抗菌活性较强的几种中草药的体外联合抑菌活性。结果表明：80种中草药水提物中对维氏气单胞菌TH0426抑菌效果较好的有五倍子、地榆、射干、鹿衔草、红花、大黄、黄连、姜厚朴,且五倍子与地榆的抑菌活性较稳定,地榆的抑菌及杀菌效果最好,MIC、MBC分别为3.91mg/mL、31.25mg/mL;联合抑菌试验表明,五倍子与射干的两两联合抑菌指数（FICI）≤0.5,五倍子分别与黄连、大青叶的两两联合抑菌指数≥0.5～≤1,地榆分别与鹿衔草、姜厚朴的两两联合抑菌指数≥2。说明五倍子与射干为协同作用,五倍子与黄连、大青叶分别为相加作用,地榆与鹿衔草、姜厚朴分别为颉颃作用。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在病原微生物中的应用

规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)广泛存在于古细菌及细菌中是细菌在长期进化过程中形成的一种获得性免疫系统。近年来以该系统为基础,经过人工改造形成的一种新型基因编辑技术—CRISPR/Cas9在基因工程领域的应用越发广泛;该技术与前两代编辑技术相比,具有结构简单、成本低廉、实用价值较高等优点。自2012年在基因研究领域成功应用后,已成为当前关注度较高的基因编辑工具;该技术在多种真核生物的基因修饰中已得到成功应用,但在病原微生物上却报道较少。本文将从CRISPR/Cas9系统的结构、作用机制及其在病原微生物基因功能研究中的应用等几个方面进行综述为其深入研究奠定基础。

东北林蛙源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定及药敏试验

为确定吉林市某林蛙养殖场发病东北林蛙的病因,本试验从患病东北林蛙腹腔和脏器中分离得到5株细菌,命名为R1~R5。通过溶血活性试验、动物回归试验和斑马鱼致病性试验,确定菌株R5具有较强的致病性,可使东北林蛙和斑马鱼致病死亡;通过生理生化和分子生物学鉴定方法,初步鉴定R5菌株为嗜水气单胞菌;通过分子生物学方法进行16S rDNA和gyrB管家基因系统进化树分析,R5菌株与嗜水气单胞菌聚类,且同源性在98%以上;致病性和毒力基因携带情况分析显示,R5菌株携带气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、脂肪酶(Lip)、密度感应系统调控基因(LuxS)这6种毒力因子;药敏试验结果显示,R5菌株对庆大霉素、四环素、氟苯尼考、氧氟沙星、环丙沙星、多黏菌素B、头孢拉啶、头孢噻肟、头孢吡肟、复方新诺明敏感,对丁胺卡那、氯霉素中介,对氨苄西林具有一定的耐药性。本试验结果可为东北林蛙嗜水气单胞菌的防治提供一定参考。

猪源生物被膜乳酸菌的筛选、鉴定与体外益生特性评价

将分离自健康猪新鲜粪便的乳酸菌进行功能性和安全性评价,旨在筛选出有利于猪健康生长的优良乳酸菌菌株。结果显示,共分离到2株对猪源大肠杆菌等病原菌具有抑制作用的乳酸菌菌株,并从中成功筛选出1株生物被膜形成能力较强的分离菌株L-8。经鉴定,分离菌株L-8为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii),具有一定的产酸能力,能够耐受胃内pH值4.0~10.0和肠道1%胰蛋白酶环境,对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)具有一定的黏附性,其生存能力和生长性能均较好。此外,分离菌株L-8对小鼠无致病性,具有安全性。综上,分离菌株L-8具有作为猪用益生菌的潜在益生特性和开发前景。

中草药提取物对东北林蛙源嗜水气单胞菌体内外抑菌试验及其抗炎免疫活性研究

为了研究五倍子、红花、黄连、地榆、射干、黄芪六味中药对嗜水气单胞菌的体内外抑菌作用,试验采用牛津杯打孔法和二倍稀释法测定嗜水气单胞菌对六味中药提取物的敏感性,以及中药提取物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),筛选出能够有效抑制嗜水气单胞菌的中药提取物,并选取健康的东北林蛙为试验对象进行体内试验,选取抑菌效果较好的中药提取物混合饲料对试验林蛙进行饲喂,共饲喂56 d,于饲喂第0,14,28,42,56天取样,检测在中药混合饲料饲喂后林蛙机体相关免疫指标[血清中酸性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LZM)的活性,心脏、脾脏、肺脏组织中白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)基因mRNA相对表达量]变化及嗜水气单胞菌攻毒后林蛙的存活率。结果表明:六味中药中,供试菌对五倍子、红花、黄连表现为中度敏感,五倍子、红花、黄连、地榆、射干、黄芪对嗜水气单胞菌的MIC分别是0.05,0.10,0.10,0.20,0.25,0.20 g/mL,MBC分别是0.10,0.15,0.25,0.25,0.40,0.40 g/mL。五倍子、红花对试验菌株的抑菌作用较强。综合体外抑菌试验结果,选择五倍子和红花两味中药进行体内试验,分为对照组、五倍子组和红花组。与对照组相比,五倍子组和红花组饲喂2周后均可使林蛙血清中AKP、SOD和LZM活性上升;心脏、肝脏和脾脏(除红花组脾脏组织第42天外)中IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ基因表达水平均有不同程度升高。五倍子和红花可有效缓解嗜水气单胞菌对东北林蛙的侵袭。说明五倍子和红花两味中药可对嗜水气单胞菌产生抑制作用,并且对感染嗜水气单胞菌的东北林蛙产生免疫调节作用。

被膜态与浮游态猪源乳杆菌上清液抑菌活性比较分析

试验旨在比较分析猪源约氏乳杆菌L-76和嗜淀粉乳杆菌L-102被膜态和浮游态下其上清液对病原菌的抑菌活性。采用结晶紫染色法测定L-76和L-102的生物被膜形成能力,研究其被膜态和浮游态乳杆菌上清液及上清液与不同影响因素作用后的抑菌活性,并利用扫描电镜观察其两种状态下的上清液对指示菌形态的影响。结果显示,L-76、L-102乳酸菌具有较强的生物被膜形成能力,被膜态和浮游态乳杆菌L-76、L-102具有良好的抑菌活性,其上清液经蛋白酶作用后,被膜态L-76和L-102上清液的抑菌圈直径比浮游态明显变小;经过氧化氢酶和不同温度作用后,两种状态的乳杆菌上清液的抑菌活性无明显变化(P>0.05),但在pH 3.0作用下,两种状态的乳杆菌上清液的抑菌效果最好;扫描电镜结果显示,被膜态乳杆菌上清液对金黄色葡萄球菌的形态影响略大。综上所述,两种状态下乳酸杆菌上清液中均含有抑菌物质,且被膜态乳酸杆菌上清液中的抑菌物质含量略多或活性略高。

维氏气单胞菌生物膜体外模型的建立及影响因素的研究

为探索不同理化因素对致病性维氏气单胞菌（Aeramonasveronii,AV）‘TH0426成膜的影响,采用改良微孔板法建立致病性AV生物膜体外模型并对其进行了研究。结果表明,AVTH0426能够在聚乙烯酶标板表面形成生物膜,PH值4~6,10℃和NaCl浓度4 g/L培养18 h是形成生物膜的最适条件,黄颡鱼（Pseudobagrusfulvidraco）的肝脏提取液对AV TH0426形成生物膜有促进作用。这为进一步探讨维氏气单胞菌生物膜形成机制和致病机理提供了参考。

猪源生物膜乳酸菌的筛选与生物学特性分析

为了筛选能够用于养猪生产中的潜在益生乳酸菌,试验从健康猪粪便中筛选出乳酸菌,并采用16S rDNA分子生物学方法进行鉴定,然后进一步对该菌株进行体外生物学特性分析和小鼠致病性试验。结果表明:从猪粪便中共分离出3株疑似乳酸菌菌株,而后从3株疑似乳酸菌菌株中成功筛选出1株具有抗菌活性和生物被膜形成能力的乳酸菌,命名为L-18,并确定乳酸菌L-18株为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。L-18株乳酸菌具有产酸能力,能够耐受50℃和60℃、pH值2.0~10.0以及1%胰蛋白酶环境;对猪小肠上皮细胞的黏附率为77.04%,与鼠李糖乳杆菌ATCC53103相比差异显著(P<0.05);在MRS液体培养基中培养大约4 h后进入对数生长期,并持续生长8 h后进入稳定期;对青霉素等8种药物高度敏感,对头孢他定等6种药物中度敏感,对庆大霉素等6种药物表现出耐药;小鼠致病性试验表明L-18株乳酸菌具有安全性,无毒性。说明L-18株乳酸菌具有益生菌的典型特性和功能,可用于开发和利用。

布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备布鲁菌(Brucella)L7/L12蛋白及其小鼠源多克隆抗体,根据猪布鲁菌(Brucella suis)S2株L7/L12基因序列,设计合成特异性引物,PCR扩增L7/L12基因并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a-L7/L12,经鉴定正确后转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为17ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western blot结果表明,原核表达后纯化的L7/L12蛋白能够与制得的小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗体特异性结合。成功获得了纯化的L7/L12重组蛋白和小鼠抗L7/L12多克隆抗体,为进一步研究L7/L12蛋白对布鲁菌感染的诊断方法和基因工程疫苗的研发奠定了基础。