蝮蛇毒小分子多肽的分离、纯化及其抗肿瘤作用研究

目的从长白山岩栖蝮蛇蛇毒中分离纯化1种小分子多肽Saxis,测定理化性质,研究其对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法利用有机溶剂沉淀和Sephadex G-50S、ephadex G-25凝胶过滤色谱等方法分离纯化长白山栖岩蝮蛇蛇毒中的1种小分子多肽Saxis;采用Tricine-SDS-PAGE鉴定;利用Bradford蛋白质测定法测定蛋白质浓度;运用MTT比色法检测该小分子多肽对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞SMMC-7721和胃腺癌细胞SGC-7901的生长抑制作用。结果该小分子多肽Saxis的相对分子质量约为5 200,它能抑制Hela、SMMC-7721和SGC-7901细胞的增殖,并且对这3种肿瘤细胞的抗增殖作用具有药物剂量依赖关系,24 h的IC50分别为66.3,54.5,62.2μg/mL。结论利用有机溶剂沉淀和凝胶过滤色谱法可以从长白山岩栖蝮蛇蛇毒中分离纯化1种小分子多肽Saxis,其对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用。

补体过度活化对急性移植物抗宿主病病理过程的影响

本研究通过建立小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型,研究aGVHD发病过程中补体系统的活化对病理过程的影响。选用近交系C57BL/6(H-2Kb)小鼠和BALB/c(H-2Kd)小鼠作为实验动物。模型组以前者作为供鼠,后者作为受鼠,给予受鼠8Gy60Coγ线全身照射后4-6小时进行骨髓细胞+脾细胞移植;对照组为同基因移植组。通过观察小鼠的体表特征、生存期以及体重变化跟踪模型组动物aGVHD的发生发展。采用流式细胞术鉴定移植后模型小鼠的基因型;运用酶联免疫吸附试验(ELISA)从蛋白水平检测整个发病过程中器官组织C3a、C5a等补体相关成分的分泌表达,同时运用荧光定量PCR技术从基因水平检测补体相关基因的表达变化;通过苏木精伊红(HE)染色对aGVHD所导致的组织损伤进行病理学分析,同时利用免疫荧光(IF)等实验技术检测补体相关成分在发病小鼠相应器官组织中的沉积,初步探讨其与组织病理损伤的内在联系。结果表明:模型组小鼠表现出典型的aGVHD特征:食欲下降、体重减轻、皱毛、弓背、活动减少、脱毛等;与对照组相比,模型组小鼠靶器官(肝脏)组织中补体相关成分的表达无论从蛋白水平还是基因水平上均有明显升高(p<0.05);组织病理学分析结果显示,模型组小鼠的靶器官组织中(肝脏的中央静脉和门管区)有显著的炎性细胞浸润,并且在浸润部位有明显的补体成分C3的沉积。结论:在小鼠aGVHD发病过程中,肝组织中的补体系统持续性地过度活化,产生的补体相关成分沉积于受损的肝组织内,沉积部位有明显的炎性细胞浸润,这说明补体系统的过度活化可能与aGVHD所导致的病理损伤有密切联系。

西罗莫司对慢性排斥反应诱发小鼠肾炎的治疗作用及可能机制

目的探讨西罗莫司对慢性排斥反应诱发小鼠肾炎的治疗作用及可能的机制。方法建立DBA/2小鼠→B6D2F1(DBA/2×C57BL/6)小鼠的慢性排斥反应诱发的小鼠肾炎模型,随机分为两组西罗莫司治疗组和模型组。西罗莫司治疗组给予西罗莫司1 mg/(kg·d),连续治疗12周;模型组给予同样剂量的橄榄油。通过尿蛋白检测及组织病理学分析确定小鼠肾炎的发生。酶联免疫吸附(ELISA)检测血清中抗核酸抗体(抗-dsDNA IgG、抗-dsDNA IgG1、抗-dsDNA IgG2a、抗-ssDNA IgG、抗-ssDNA IgG1、抗-ssDNA IgG 2a)的水平;实时定量PCR检测肾脏中的炎性因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IL-1β、趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、B细胞趋化因子(BLC)、转化生长因子(TGF)-β1和胶原蛋白(collgen)Ⅰ的水平;直接荧光标记检测外周血或脾中T、B淋巴细胞的活化水平及调节性T细胞(Treg)的比例变化。结果 12周观察期结束时,西罗莫司组小鼠肾炎的发病率明显低于模型组(P<0.05);病理结果显示,模型组的小鼠肾组织有明显的血管内膜增生及炎性细胞浸润,西罗莫司组的小鼠肾组织趋于正常;建模后5周,ELISA结果显示,西罗莫司组小鼠血清中自身抗体及抗核抗体水平较模型组显著降低(P<0.05);实时定量PCR结果显示,西罗莫司组小鼠肾IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、MCP-1、RANTES、BLC、TGF-β1及collgen I的mRNA表达转录水平均明显低于模型组(P<0.05);流式测定结果显示,西罗莫司组小鼠外周血中活化/记忆性T细胞比例、脾中T、B细胞表面活化分子水平较模型组均显著降低(P<0.05);与模型组相比,西罗莫司组小鼠脾中CD4+FOXP3+Treg细胞的比例明显上调(P<0.05)。结论西罗莫司可能通过上调CD4+FOXP3+Treg细胞水平,抑制效应细胞的增殖活化,下调趋化因子和炎性因子的表达,从而有效延缓小鼠慢性排斥肾炎的发生。

小鼠狼疮样肾炎模型的建立

目的:研制可诱导的小鼠狼疮样肾炎模型。方法:本研究利用正常成年DBA/2J与C57BL/6杂交子一代(B6D2F1)(雄性)小鼠为受体鼠,接受多次大量DBA/2J(雄性)小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞的静脉输注(每周2次,共4次),2个月左右大部分受体小鼠出现局部胡须脱落、腹水、毛发变色等现象。结果:ELISA显示血清中IgG、IgG1和IgG2含量明显增加(P<0.01)。考马斯亮蓝染色法检测显示,近80%实验组小鼠出现蛋白尿,而对照组小鼠未发现存在尿蛋白。病理学分析显示,皮肤、肠道、肝脏和肾脏均有炎性细胞浸润,尤以肝脏、肾脏病变为著。结论:提示已初步建立了较稳定的小鼠狼疮样肾炎模型,为相关后续研究提供了有益的资料。

一种表现为皮肤胶原沉着病的小鼠慢性移植排斥模型的建立

目的建立一种小鼠慢性移植排斥模型。方法将6～8周龄BALB/c(雌性)小鼠经6 Gy60Co全身照射后随机分为同基因移植组和异基因移植组。异基因组尾静脉输注未经照射的B10.D2(雄性)小鼠的骨髓细胞和脾细胞的混合悬液。移植术后通过小鼠性染色体基因组检测、组织病理学分析,以及流式细胞仪和实时定量PCR检测确定小鼠病变的发生。结果病理学分析显示,异基因组小鼠主要表现为皮肤损伤,与同基因组相比,皮肤明显增厚,皮肤弹性降低,真皮层炎性细胞浸润,毛囊和脂肪减少或消失,大量的纤维组织增生,皮下组织出现明显结构改变;性染色体基因组分析显示,异基因组受者小鼠皮肤内有供者小鼠细胞的浸润;流式结果显示,异基因组小鼠皮肤内CD11b、CD45和CD3表达明显增强;实时定量PCR检测结果显示,异基因组小鼠皮肤RANTES、TGF-β1以及胶原蛋白ⅠmRNA水平明显升高。结论与同基因组小鼠相比,异基因组小鼠表现为皮肤胶原沉着病损伤;CD11b+、CD45+和CD3+细胞以及趋化因子RANTES和细胞因子TGF-β1参与了这一病理过程的发生。本研究建立了一种表现为皮肤胶原沉着病的小鼠慢性移植排斥反应模型,为相关后续研究提供了有益的基础。

小鼠尾静脉注射的操作体会

由于小鼠体型小，生长繁殖快，成本低，易于控制，因此常被用作医学实验动物。但由于小鼠尾静脉细，穿刺难度大，很大程度上制约了实验的成功与否。本实验室经过长期的动物实验，掌握了单人小鼠尾静脉注射技术，保证了实验的顺利完成。

Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用研究

目的探讨Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用及其机制。方法通过RNA干扰降低Tim-3在巨噬细胞表面的表达,构建一种稳定低表达Tim-3的RAW264.7巨噬细胞系;以野生型及低表达Tim-3的巨噬细胞为研究对象,探讨Tim-3对巨噬细胞活性及表型的影响。结果将含Tim-3 siRNA及NC对照序列的载体经脂质体分别转染细胞系RAW264.7,以G418加压筛选,获得低表达Tim-3的巨噬细胞稳定株。功能实验显示,激活Tim-3通路促进了巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6。同时发现Tim-3通路可以影响CD80/CD86共刺激分子在巨噬细胞表面的表达,并进而影响巨噬细胞的抗原呈递功能,促进Th1、Th17细胞的极化。结论成功构建了重组载体Tim3 siRNA,建立了稳定低表达Tim-3的巨噬细胞系,初步研究结果提示Tim-3信号通路在促进TNF-α、IL-6分泌及调节巨噬细胞共刺激分子表达,促进Th1、Th17细胞分化中发挥重要作用。

慢性移植排斥反应诱导的小鼠肾炎发生因素的初步探讨

目的探究慢性移植排斥反应诱导小鼠肾炎的发生机制,为下一步药物治疗提供实验依据。方法建立DBA/2→B6D2F1(DBA/2J×C57BL/6)移植小鼠模型,通过尿蛋白检测以及组织病理学分析确定小鼠肾炎的发生;利用直接免疫荧光标记技术以及实时定量PCR分析慢性移植排斥反应诱导小鼠肾炎发生过程中T、B淋巴细胞的活化情况,以及靶组织器官中各种因子或蛋白的变化。结果与同系基因型移植对照组(B6D2F1→B6D2F1)小鼠相比,异体移植实验组(DBA/2→B6D2F1)小鼠脾细胞中CD4+CD69+、CD8+CD69+双阳性细胞百分比均明显增加,B220+I-Ab+双阳性细胞的I-Ab表达显著增强,提示T、B淋巴细胞的活化;另外,在实验组小鼠肾组织中,趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、B淋巴细胞趋化因子(BLC)以及淋巴细胞趋化因子(Ltn)表达上升;炎性细胞因子(如IL-6、IL-1β)表达显著增强;促纤维生长因子如转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)以及纤维增生相关蛋白如Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)的mRNA表达水平明显上升,提示组织炎症以及纤维化的发生。结论慢性移植排斥反应诱导肾炎发生可能与激活淋巴细胞以及炎症因子、趋化因子和促纤维生长因子的分泌表达有关。