雌性牦牛主要生殖器官中DBI的表达与定位分析

为加深对DBI基因功能的探究,揭示其在牦牛生殖生理过程中的作用。本试验采集健康母牦牛(3~6岁)繁殖周期不同阶段(卵泡期、黄体期和妊娠期)的卵巢、输卵管和子宫组织,共分为9组,每组设置3个生物学重复。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹技术(Western blotting,WB)检测牦牛DBI在繁殖周期不同阶段雌性牦牛生殖器官中的相对表达量;通过免疫组织化学方法(immunohistochemistry,IHC)定位DBI蛋白在雌性牦牛卵巢、输卵管和子宫中的分布情况。结果表明:1)qRT-PCR结果显示,在卵巢中,DBI在黄体期和妊娠期的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);在输卵管中,DBI在黄体期表达量显著高于卵泡期和妊娠期(P<0.05);在子宫中,DBI在妊娠期表达量最高,黄体期次之,卵泡期最低。2)Western blotting结果表明,在卵巢中,DBI在妊娠期的水平显著高于卵泡期和黄体期(P<0.05);在输卵管中,DBI在黄体期水平显著高于卵泡期和妊娠期(P<0.05);在子宫中,DBI在妊娠期水平明显高于黄体期和卵泡期(P<0.05)。3)IHC结果显示,DBI主要位于生殖上皮细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞、黄体细胞、输卵管上皮细胞、子宫基质细胞和子宫腺中。DBI在牦牛繁殖周期不同阶段的卵巢、输卵管和子宫组织中的表达量存在显著差异,说明其参与牦牛生殖生理调控,为进一步挖掘DBI基因在高原哺乳动物生殖方面的研究奠定相应的理论基础。

牦牛DBI基因的分子特征及其在乳腺组织中的表达与定位

地西泮结合抑制因子(Diazepam binding inhibitor,DBI)与酰基辅酶A具有高亲和力,在动物组织中广泛存在,与脂肪酸代谢、类固醇激素合成密切相关。为研究DBI基因的分子特征及该基因在乳腺发育中的作用,对牦牛DBI基因编码区进行克隆,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹技术(Western blotting,WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法对牦牛泌乳前期、泌乳期和干乳期的乳腺组织中DBI的相对表达量和表达部位进行研究。DBI序列分析显示:牦牛DBI基因编码区序列长264 bp,编码87个氨基酸残基,与牛的同源性高达99.62%;qPCR数据表明:牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI基因的相对表达量显著高于泌乳期和干乳期(P<0.05);WB结果显示:牦牛泌乳前期乳腺组织中DBI蛋白的表达量最高,干乳期次之,泌乳期最低(P<0.05);IHC结果表明:不同发育时期的牦牛乳腺组织中DBI的表达部位并无明显差异,主要表达于乳腺腺泡上皮细胞、导管上皮细胞及小叶间质细胞。DBI在不同发育时期牦牛乳腺组织中的相对表达量具有明显差异(P<0.05),揭示DBI可能参与牦牛乳腺发育的过程,这为进一步探究DBI基因在生物体中的作用提供相应的理论参考。

Hsp70在小鼠体外早期胚胎发育中的表达

为探究热休克蛋白Hsp70在小鼠体外早期胚胎发育中的表达情况以及Hsp70在胚胎发育中的作用机理,本试验采集8~12周龄SPF小白鼠的卵巢,在体式显微镜下采集卵母细胞并培养成熟,用0. 1%透明质酸酶消化卵丘卵母细胞复合体后,放入SrCl2+CB液中进行5 h(37℃)的孤雌激活,然后移入G1培养液进行培养。取培养至2细胞期、4~8细胞期、9~16细胞期、桑椹期和囊胚期的小鼠胚胎提取总RNA,通过实时荧光定量PCR检测Hsp70在各个时期的表达情况,免疫荧光染色检测其在各个时期小鼠胚胎的表达定位。实时荧光定量PCR结果表明,Hsp70在小鼠体外早期胚胎的2细胞期、4~8细胞期、9~16细胞期、桑椹期、囊胚期都有表达,但在2细胞期胚胎和4~8细胞期胚胎的相对表达水平较高,在9~16细胞期胚胎、桑椹期胚胎和囊胚期胚胎的相对表达水平较低。免疫荧光染色结果显示,Hsp70定位于各个时期胚胎的细胞核和细胞质中,但9~16细胞期以后Hsp70主要定位于细胞核中。综上所述,Hsp70对小鼠体外早期胚胎的发育具有潜在的调控作用,这为进一步明确热休克蛋白Hsp70在胚胎抗热应激中的作用及机理研究提供了理论依据。

Mfn2在不同繁殖生理时期牦牛卵巢和输卵管中的表达及定位

为探索线粒体融合蛋白2(Mfn2)在不同繁殖生理时期牦牛卵巢和输卵管中的表达情况与分布特征,选取处于不同繁殖生理时期健康牦牛15头,分为3组,每组5头,屠宰后采集处于卵泡期、黄体期和妊娠期牦牛的卵巢和输卵管组织样品,分为6个组,分别提取各组卵巢和输卵管组织样品总RNA和蛋白,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测Mfn2 mRNA及其蛋白在6个组的组织中的表达情况;用IHC法检测Mfn2蛋白在组织中的定位。RT-qPCR检测结果表明,6个组的组织中Mfn2 mRNA均有表达且存在差异,Mfn2 mRNA在妊娠期表达量最高,其次为黄体期,卵泡期最低,且各组之间差异显著(P<0.05)。Western blot结果发现,Mfn2蛋白在6个组的组织中均有所表达。在卵巢组织中,妊娠期最高,与黄体期和卵泡期差异显著(P<0.05),黄体期与卵泡期差异显著(P<0.05)。而在输卵管中,黄体期最高,与妊娠期差异显著(P<0.05);在卵泡期次之,与妊娠期差异显著(P<0.05),与黄体期差异不显著(P>0.05)。IHC结果显示,在卵巢中,Mfn2主要分布在卵巢卵泡膜、黄体细胞、生殖上皮,在输卵管中主要分布在黏膜上皮和肌层中,说明Mfn2在不同繁殖生理时期牦牛的卵巢和输卵管中均有所表达且有差异。

GCNF在牦牛睾丸不同发育阶段中的表达与定位

生殖细胞核因子(GCNF)是核受体超家族的一员。相关研究发现,GCNF在睾丸和卵巢中高表达,可能在配子减数分裂中发挥作用。为探究GCNF在牦牛睾丸中的表达与定位,采集牦牛不同发育阶段(幼年、成年、老年)的睾丸组织,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测GCNF基因在组织中的相对表达量;采用Western-blot(WB)检测GCNF蛋白在不同年龄阶段睾丸中的表达水平;免疫组织化学方法分析GCNF在牦牛睾丸分布特征。qRT-PCR和WB检测结果显示,GCNF在牦牛睾丸不同年龄阶段均有表达,且表达存在差异性。幼年期GCNF在基因水平和蛋白水平表达量最高且显著高于成年期和老年期;老年期显著高于成年期,成年期表达量最低。免疫组织化学结果显示:在睾丸不同发育阶段GCNF的表达定位无明显差异,主要在生精细胞和圆形精子细胞中表达,间质细胞和支持细胞中也有少量表达。上述研究结果表明,GCNF可能参与精子的发生及分化变形,这为牦牛生殖生育研究提供了理论基础和新的依据。