环状RNA的体外构建及表达

目的利用真核生物mRNA成熟过程中内含子外显子置换(permuted intron exon,PIE)策略,构建可在体外环化(in vitro cyclization,IVC)并具有翻译功能的RNA,转染HEK-293T细胞后进行表达。方法选取具备Ⅰ型催化内含子(groupⅠcatalytic intron)的5’和3’环化臂、柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)以及目的基因序列构建模板质粒,通过PCR法获得线性化质粒模板,经体外转录(in vitro transcription,IVT)合成线性RNA,依次添加环化试剂完成IVC得到环状RNA(circular RNA,circRNA)。采用琼脂糖凝胶电泳及核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)消化的方式确认RNA环化。将分别携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)及流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)(IVR-180)的circRNA转染HEK-293T细胞,逐一验证其体外表达情况。结果RNA环化后电泳主条带变小,且出现环化产生的小片段,经RNase R消化,仅环化后RNA条带仍有部分保留。转染EGFP-circRNA的HEK-293T细胞荧光显微镜下可见明显绿色荧光;转染Fluc-circRNA的HEK-293T细胞Fluc表达值平均为未环化RNA的20倍以上,且随Fluc-circRNA转染剂量的升高,荧光数值(relative light unit,RLU)呈上升趋势;Western blot分析显示,转染HAcircRNA的HEK-293T细胞成功表达了HA蛋白。结论在体外成功环化了线性RNA并完成不同蛋白的表达,为新型流感疫苗及mRNA疫苗的研究奠定了基础。

稳定表达胰蛋白酶原的重组MDCK细胞分离流感病毒效果初步分析

目的 初步考察稳定表达胰蛋白酶原的重组MDCK细胞(即MTY6细胞)分离流感病毒的效果。方法 按照世界卫生组织(World Health Organization,WHO)全球流感监测网络和国家流感中心(National Influenza Centers,NICs)推荐的病毒分离方法,使用MDCK和MTY6细胞同步分离包含H1N1、H3N2和B型流感病毒核酸阳性的咽拭子样本共20份,对分离培养液分别使用豚鼠红细胞和鸡血红细胞进行凝集试验,统计比较不同类型红细胞凝集效果,以及不同细胞分离病毒阳性率和血凝素滴度。结果 相同病毒分离物对两种类型红细胞的凝集效果不同,豚鼠红细胞完全凝集时间约为鸡血红细胞2倍,沉积形状呈环状,血凝滴度平均为鸡红细胞的23.6±1.2倍。相同条件下,有3份样本两种细胞均分离阴性,11份样本两种细胞均分离阳性,其余6份样本MDCK细胞分离阴性,而MTY6细胞分离阳性,MTY6细胞分离阳性率较MDCK细胞高30%;分离阳性样本包括H1N1亚型8份,MTY6细胞分离病毒血凝素滴度显著高于MDCK细胞,平均为13.0(1.7,23.0)倍;H3N2亚型和B型各2份,MTY6细胞分离病毒血凝素滴度均高于MDCK细胞,平均为11.3和32.0倍。结论 综合考虑,对于细胞分离流感病毒检测,豚鼠红细胞优于鸡血红细胞。相同条件下,MTY6细胞较MDCK细胞分离流感病毒的灵敏度更高,具有作为流感病毒分离优质细胞基质的潜力。

重组流感血凝素三聚体蛋白疫苗的制备及免疫原性评价

目的制备重组流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)三聚体蛋白疫苗并进行相关表征分析,研究重组HA三聚体在小鼠模型中的免疫原性。方法构建稳定表达HA三聚体蛋白的CHO细胞株,通过Western blot、单向免疫扩散试验、蛋白质粒径检测和N-糖基化位点分析对重组蛋白进行定性及定量分析。根据剂量、佐剂等处理条件的不同将BALB/c小鼠分为11个组,并进行一致的免疫程序。初次免疫后56 d检测血清中和抗体效价,以评价免疫原性。结果构建的CHO细胞株能够分泌表达HA三聚体。HA三聚体具备生物学活性能够在单向琼脂免疫扩散试验中形成沉淀环,蛋白质粒径大小约为18.79 nm,具有10个N-糖基化位点,包括高甘露糖型、复合糖型和杂合糖型;HA三聚体重组蛋白疫苗在2次免疫小鼠后,3.75μg剂量配伍RFH01佐剂与对照组单价疫苗原液15μg引起的中和抗体效价差异无统计学意义(P=0.4312,U=36),配伍佐剂组免疫后血清抗体效价均高于未加佐剂组,其中15μg HA三聚体+RFH01组效价最高,为1280。结论成功制备了流感病毒重组HA三聚体蛋白,其与RFH01佐剂配伍能够诱导BALB/c小鼠产生针对流感病毒的体液免疫应答,为流感病毒重组亚单位疫苗的研发提供了参考。

甲型流感病毒重组血凝素蛋白的真核表达及免疫效力分析

利用真核表达系统稳定表达HA重组蛋白并评价其免疫原性及攻毒保护效果,为重组流感亚单位疫苗的研制提供更多的理论基础。本研究以H1N1型流感病毒HA胞外区域序列为目的基因构建重组质粒KS001-HA并转染至CHO细胞得到表达重组蛋白rHA的单克隆细胞株,通过离子交换层析法纯化rHA。将rHA与佐剂联合免疫小鼠以评估免疫原性,并对免疫后的小鼠进行攻毒,监测小鼠存活率和体重变化,检测其肺组织病毒载量,并分析肺组织的病理变化。重组质粒KS001-HA在CHO细胞中稳定整合并分泌表达rHA蛋白,其相对分子质量约70 kD,经PNGaseF酶处理后,蛋白大小变为60kD。纯化后rHA蛋白纯度>95%。加强免疫后小鼠血清抗体效价显著增强,佐剂配伍免疫效果优于rHA单独免疫,其中HA203佐剂配伍组15、30、60μg剂量组免疫效应显著高于阳性对照组H1N1疫苗原液组。攻毒后HA203佐剂配伍组无小鼠死亡,小鼠体重平均下降率低于10%,肺组织肺泡结构清晰,仅见肺泡壁轻度增厚,伴随少量的炎性细胞浸润,仅检测到少量呈灶性分布的棕黄色颗粒。本研究成功构建了重组质粒KS001-HA,于CHO细胞中表达,并筛选出稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株。rHA蛋白以单体形式存在且糖基化丰富。rHA蛋白独自作用小鼠产生的免疫原性较低且不能保护小鼠抵抗H1N1型流感病毒的攻击,rHA蛋白联合佐剂免疫小鼠后具有较好的免疫原性,以HA203佐剂效果最好。HA蛋白配伍HA203佐剂可以诱导小鼠产生特异性体液免疫保护小鼠抵御H1N1型流感病毒的攻击,减少炎性细胞浸润,有效抑制病毒的复制。

H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在无血清悬浮培养MDCK细胞中传代稳定性的评价

目的 评价H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在无血清悬浮培养MDCK细胞(sMDCK)中的传代稳定性。方法 将H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株工作种子批在sMDCK细胞中连续传15代。采用二代及一代测序法检测主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10和P15代病毒HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2 8段基因核苷酸序列的稳定性;以肽段覆盖率为指标评价工作种子批、P5、P15代病毒主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白氨基酸序列的稳定性;选取工作种子批、P5和P15代病毒制备流感疫苗,经肌内免疫雌性BALB/c小鼠,每组10只,15μg HA/只,28 d后加强免疫1次,剂量及给药途径同初次免疫,于初次免疫后28、42、56 d,检测血清中和抗体效价,评价免疫原性的稳定性。结果 各代次流感病毒均未检测到片段插入或缺失,核苷酸序列与主种子批序列完全一致;主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10代病毒均未发生单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)突变,但P15代病毒多个基因位点存在SNP突变的可能性,其中杂合SNP数占91.62%。P5和P15代病毒的HA、NA蛋白肽段覆盖率为96.7%~100%。初次免疫后28、42、56 d,工作种子批、P5和P15代病毒免疫小鼠血清中和抗体效价差异均无统计学意义(H分别为2.253、2.029、1.408、P分别为0.324、0.363、0.495)。结论 H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在sMDCK细胞中具有良好的遗传稳定性,有望应用于sMDCK细胞基质大流行流感疫苗的生产。

以流感病毒血凝素为靶标的抗病毒防治策略研究进展

流感是由流感病毒引起的一种在全球范围内流行的传染病,从1918年追溯至今,已给公共健康和社会稳定带来了巨大的冲击。目前,接种流感疫苗是预防和控制流感流行的最有效方式。近几年,对广谱抗病毒药物和中和抗体的研究不断深入。流感病毒表面血凝素在病毒侵入宿主细胞阶段发挥重要作用,是现有流感疫苗的主要有效抗原成分,也是广谱中和抗体、广谱抗病毒药物的主要靶标。本文就近年来基于流感病毒血凝素的新型流感疫苗、中和抗体以及抗病毒药物等防治策略的研究进展进行综述,为后续流感的预防和控制提供新的思路。

H5N1型流感病毒灭活疫苗(MDCK细胞)原液蛋白成分分析

目的 对H5N1型流感病毒灭活疫苗(MDCK细胞)原液蛋白成分进行分析,为完善该疫苗的质量控制方法及疫苗的研发提供依据。方法 将H5N1型流感病毒株接种于MDCK细胞,病毒培养48 h后,收获病毒液,经澄清、超滤浓缩、β-丙内酯灭活、Capto Q和Sephorase 4FF两步层析纯化,获得原液样品。应用透射电镜分析样品中病毒颗粒的形态;单向免疫扩散(single radial immunodiffusion,SRID)试验鉴别病毒原液血凝素(hemagglutinin,HA);高效液相色谱进行纯度分析;梯度SDS-PAGE进行蛋白电泳分析;液质联用仪(LC/MS)结合对回收的各条带蛋白多肽进行二级质谱序列测定的方法分析样品中所含的蛋白成分。结果 在透射电镜下可观察到80~120 nm球形H5N1流感病毒颗粒,呈典型的流感病毒形态;鉴别试验表明病毒原液抗原性与病毒株相一致;经梯度SDS-PAGE分析,病毒原液有2条带;LC/MS质谱分析显示,原液样品中H5N1型流感病毒蛋白为主要成分,包括H5N1型流感病毒的NP、M1、HA、NA等蛋白。结论 对H5N1型流感病毒灭活疫苗制备过程中原液的蛋白成分进行了分析,为该类疫苗的研发及质量控制提供了参考依据。

不同层析介质纯化H5N1型流感病毒的研究

目的分别用新型复合层析介质Capto Core700和传统分子筛介质Sepharose 4FF纯化MDCK细胞制备的H5N1型流感病毒浓缩液,并比较分离纯化效果。方法用Capto Core700与Sepharose 4FF纯化灭活H5N1型流感病毒浓缩液,透射电镜分析不同样品中病毒颗粒的形态;分别用单向免疫扩散法(single radial immunodiffusion,SRID)、福林酚法(Lowry法)、双抗体夹心ELISA、qPCR检测不同层析介质纯化前后病毒血凝素含量、总蛋白质含量、宿主细胞蛋白质(host cell protein,HCP)含量和宿主细胞DNA(host cell DNA,HCD)含量,计算病毒抗原回收率和杂质去除率;用动物实验检测不同纯化病毒的免疫原性,并用t检验分析两种层析介质纯化效果差异。结果Capto Core700与Sepharose 4FF纯化的H5N1型流感病毒在透射电镜下均呈典型的流感病毒形态;两种层析介质纯化后病毒血凝素回收率差异无统计学意义(P>0.05),但前者的杂质(总蛋白质、HCP、HCD)去除率均高于后者,且差异有统计学意义(P<0.05);动物实验表明两种层析介质纯化的病毒样品均具有良好的免疫原性。结论相对于Sepharose 4FF层析介质,Capto Core700在保证病毒抗原蛋白回收率的基础上可以更有效地去除HCP、HCD和总蛋白质等工艺相关杂质。本研究为MDCK细胞生产H5N1型流感病毒疫苗纯化工艺开发提供了参考。

重配法制备适用于MDCK细胞的新型H1N1流感病毒疫苗株

目的 利用不同型别流行性感冒病毒(influenza virus,简称流感病毒)共感染细胞可发生基因组重配,用H1N1(IVR180)和H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells, MDCK细胞)上自然重配,以筛选获得适用于MDCK细胞生长的新型H1N1流感疫苗株。方法 将甲型流感病毒株H1N1(IVR180)与能在MDCK细胞上复制并表现出高滴度的H5N1(NIBRG-14)毒株共感染MDCK细胞,向有共感染细胞的培养液中添加H5N1抗血清进行压力筛选以降低亲本H5N1流感毒株,使用蚀斑筛选单克隆毒株后,通过反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)进行重配毒株的筛选鉴定,并对毒株的序列、毒力、免疫原性及遗传稳定性进行了评价。结果 H1N1和H5N1重配毒株rH1-C7经过RT-PCR及基因测序证明其HA、NA、NS、M、NP与IVR180毒株同源性为100%,PA、PB1、PB2基因与NIBRG-14株同源性为100%;rH1-C7感染MDCK细胞后,血凝滴度达到1 024;毒株灭活后接种小鼠,小鼠产生了能够中和H1N1(IVR180)毒株的特异性抗体,且血清效价高于亲本IVR180疫苗株。结论 通过基因重配获得了适应于在MDCK细胞上增殖的新型H1N1流感病毒疫苗株,且疫苗株灭活后具有较高的免疫原性,为MDCK细胞基质流感病毒疫苗株的制备奠定了基础。

细胞基质流感疫苗研发的意义及进展

流感是由流感病毒导致的传染病,在世界范围内已造成大规模的人类和家禽死亡,给社会带来了严重的经济损失。接种疫苗是控制流感传播的最好方法。目前鸡胚基质流感疫苗和细胞基质流感疫苗,在国外市场上均有上市产品。细胞基质流感疫苗在生产上相比传统鸡胚工艺具有更严格的无菌环境,生产规模更易扩大,更加灵活,过敏来源更少,扩增的病毒更匹配人类使用等诸多优势。但细胞基流感疫苗在生产中也面临挑战,如病毒滴度如何进一步提高,如何选育出抗原产量更高的细胞株,如何优化反应器的培养条件等。本文综合比较了鸡胚基质流感疫苗与细胞基质流感疫苗,并对细胞基质流感疫苗开发的意义、面临的困难及国内外目前的研究进展进行综述。

细胞培养流感病毒H5N1的纯化方法研究

目的降低H5N1甲型流感病毒中宿主细胞残留蛋白质和DNA含量。方法首先使用Core 700分子筛去除宿主残留蛋白质,再使用Capto Q阴离子交换层析柱去除宿主残留DNA,对多批次MDCK细胞培养的H5N1病毒液进行纯化。纯化后的病毒液经荧光定量PCR、血凝试验、单扩试验等结果综合评价纯化效果。除层析外,本实验还设置了广谱核酸酶对照组。结果在不使用广谱核酸酶的条件下,宿主DNA去除率为99.62%,宿主蛋白质残留去除率为98.1%,血凝素(HA)抗原回收率为66.96%。结论本研究提供了一套对于以细胞基质制备的流感疫苗有较好效果的纯化策略,宿主细胞的DNA和蛋白质有较高去除率,且HA回收率较高,纯化结果不劣于添加广谱核酸酶的方法,有可能应用于实际疫苗生产。

MDCK细胞基质与鸡胚基质单价流感疫苗在小鼠中诱导的免疫反应的比较研究

目的:比较鸡胚基质和细胞基质的H1N1单价流感疫苗在小鼠体内诱导的免疫反应的差异。方法:分别采用鸡胚基质和MDCK细胞基质H1N1流感疫苗注射C57BL/6小鼠,通过体外中和实验,胞内细胞因子染色及多细胞因子检测比较2种基质生产的单价流感疫苗诱导的体液及细胞免疫反应的差异。结果:体液免疫方面,细胞基质疫苗组血清滴度与鸡胚基质疫苗组血清滴度基本一致。在细胞免疫方面,细胞基质疫苗组的细胞免疫相关细胞因子分泌水平更加显著。结论:由于病毒培养基质的不同,2种流感单价疫苗在诱导免疫反应时间存在一定差异。细胞疫苗具有诱导多种免疫反应的优势,综合细胞工艺的其他优势,说明利用细胞工艺生产流感疫苗将会成为趋势。本实验有助于评价不同基质制备的单价流感疫苗在小鼠中诱导的免疫水平。

脊髓灰质炎病毒类病毒颗粒作为候选疫苗的研究进展

脊髓灰质炎是一种由脊髓灰质炎病毒引发的高感染性疾病,该病可导致瘫痪甚至致命。口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(live attenuated oral poliovirus vaccine,OPV)和脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine,IPV)的使用为全球消灭脊髓灰质炎的主要途径,但目前的OPV及IPV均存在生物安全隐患。脊髓灰质炎病毒类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)可保留原病毒的大量重要抗原表位,诱导较强的免疫反应,且无生物安全隐患,是一种具有巨大潜力的疫苗。本文结合全球范围内OPV与IPV的使用情况,对目前脊髓灰质炎病毒VLPs的研究现状及其作为脊髓灰质炎疫苗的意义和目前的困难作一综述。

4型流感病毒疫苗株在MDCK细胞中增殖条件的优化

目的优化4型流感病毒疫苗株H1N1(IVR-215)、H3N2(NIB-121)、BV(BVR-11)、BY(BVR-1B)在稳定表达牛胰蛋白酶原的MDCK细胞(MTY6)和MDCK细胞中的增殖条件,并比较MTY6和MDCK细胞培养不同型别流感病毒的差异。方法以血凝滴度和病毒滴度[半数组织感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID_(50))]为指标,通过棋盘法对4型流感病毒疫苗株在MTY6和MDCK细胞上种毒的MOI(10^(-1)、10^(-2)、10^(-3)、10^(-4))、胰酶终浓度(0.5、1、1.5、2μg/mL)及收毒时间(0、24、48、72、96 h)进行优化;以接毒后细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)为指标,分析两种细胞对不同型别流感病毒的敏感性。结果 H1N1、H3N2、BV和BY株病毒在MTY6细胞中培养的最适MOI分别为10^(-4)、10^(-4)、10^(-2)、10^(-2),胰酶终浓度分别为0.5、1、0.5、0.5μg/mL,收毒时间分别为96、72、48、72 h。H1N1、H3N2、BV和BY株病毒在MDCK细胞中培养的最适MOI均为10^(-4),胰酶浓度为0.5、1、0.5和1.5μg/mL,收毒时间为96、48、72和72 h。4型流感病毒疫苗株在MTY6细胞中培养比在MDCK细胞中具有更高的血凝滴度和TCID50。在相同时间内,H1N1、H3N2、BY株病毒在MTY6细胞中比在MDCK细胞中能够引起更明显的CPE。结论成功优化了4型流感病毒疫苗株在MTY6细胞中的增殖条件,MTY6细胞与MDCK细胞相比,培养4型流感病毒疫苗株能够获得更高的病毒滴度,并增加病毒产量。本研究为MTY6细胞用于流感疫苗生产奠定了基础。

单价和五价轮状病毒疫苗保护效果的Meta分析

目的 评价两种主流轮状病毒疫苗Rotarix和RotaTeq对重症轮状病毒胃肠炎和任意严重程度轮状病毒胃肠炎的流行病学保护效果.方法 检索2006年1月至2017年10月公开发表的有关这两种疫苗流行病学保护效果的随机对照试验文献,采用RevMan 5.3软件和STATA 11.0软件进行Meta分析.结果 共纳入12篇文献,总研究对象为53 573人.对于重症轮状病毒胃肠炎,汇总的保护效果为85％（95％CI：74％～92％）;在发达国家或地区汇总的保护效果为92％（95％CI：88％～94％）;在中国广西的汇总保护效果为75％ （95％CI：63％～83％）.对于任何严重程度的轮状病毒胃肠炎,汇总的保护效果为67％（95％CI：53％～77％）,在发达国家或地区的汇总保护效果为76％（95％CI：72％～80％）;在中国广西的汇总保护效果为64％（95％CI：54％～72％）.结论 这两种轮状病毒疫苗都能有效预防重症轮状病毒胃肠炎的发生,对任意严重程度轮状病毒胃肠炎也有较好的保护效果.

宿主细胞残留DNA片段大小分布检测方法的建立及验证

目的建立宿主细胞残留DNA片段大小分布的检测方法,并进行验证,为监控疫苗生产过程提供依据。方法基于高灵敏的微型化芯片毛细管电泳法,用MDCK细胞基因组DNA作为阳性对照品,建立检测方法,并验证方法的检测范围、准确性及精密度。利用建立的方法分析MDCK细胞基质流感疫苗生产过程中间品(H1N1型流感病毒收获液、病毒微滤液、核酸酶处理收获液、浓缩病毒液、层析病毒液)残留DNA片段大小分布。结果 MDCK细胞基因组浓度为933.06 ng/μL,A_(260/280)值为2.079,可作为阳性对照。该方法检测范围为35~10 380 bp,精密度检测CV均小于10%。用该方法检测H1N1型流感病毒疫苗中间品,结果显示宿主细胞基因组大片段被核酸酶处理成小片段,层析病毒液300 bp以下片段占总外源DNA的84%。结论建立了一种测定MDCK细胞基质流感疫苗宿主细胞残留DNA片段大小分布的检测方法,该方法精密度良好,有望用于连续细胞系衍生生物制品的原液检定和质量控制。

H1N1型流感病毒血凝素蛋白胞外段的真核表达及免疫原性分析

目的真核表达H1N1型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白胞外段,并分析其免疫原性。方法以H1N1型流感毒株基因组为参考序列,将H1N1 HA的胞外段氨基酸序列进行密码子优化后基因合成,将合成的目的基因片段与KS001载体连接,构建重组质粒KS001/HA,转染至Expi293F真核细胞,收集表达产物,进行12%SDSPAGE、Western blot及N-糖基化鉴定;将表达产物经Capto Q离子交换层析柱纯化,收集纯化产物进行12%SDSPAGE鉴定,BCA法测定蛋白浓度;用不同浓度的HA胞外段蛋白辅以佐剂免疫小鼠,通过病毒微量中和试验(microneutralization test,MNT)检测小鼠血清抗体效价。结果经菌液PCR、双酶切及测序鉴定证明质粒构建正确;表达的重组蛋白以单体形式存在,相对分子质量约70000,N-糖基化丰富;重组蛋白与佐剂配伍后的各剂量组均产生针对H1N1型病毒特异性抗体,且阳转率≥90%。结论成功构建了重组质粒KS001/HA,并于真核细胞中表达,表达产物联合佐剂免疫小鼠后具有较好的免疫原性。

四价流感病毒灭活疫苗在18~64岁人群免疫原性和安全性的系统综述和Meta分析

目的用Meta分析的方法评价四价流感病毒灭活疫苗在18~64岁人群的免疫原性(抗体保护率和抗体阳转率)。方法检索Medline、Cochrane Library、Science Direct数据库,将近10年内发表的比较18~64岁人群接种四价流感病毒灭活疫苗和三价流感病毒灭活疫苗免疫原性的临床随机对照试验纳入分析。采用Revman 5-3软件对纳入文献数据进行Meta分析。结果共纳人8篇文献,针对甲型流感株(A/H1N1、A/H3N2)的抗体保护率和抗体阳转率,两种疫苗的反应差异无统计学意义;针对不含乙型流感株B/Victoria的三价流感病毒灭活疫苗,四价流感病毒灭活疫苗抗体保护率的合并RR值为1.28(95%a:1.08~1.51,P<0.05),抗体阳转率的合并RR值为1.94(95%CI:1.50~2.50,P<0.05);针对不含乙型流感株B/Yamagata的三价流感病毒灭活疫苗,四价流感病毒疫苗抗体保护率的合并RR值为1.10(95%CI:1.02~1.18,P<0.05),抗体阳转率的合并RR值为1.99(95%CI:1.34~2.97,P<0.05),差异有统计学意义。结论18~64岁人群中,四价流感病毒灭活疫苗与三价流感病毒灭活疫苗对于相同的疫苗株产生的免疫原性无差异,对于三价流感病毒灭活疫苗中不含的乙型疫苗株能产生良好的免疫效果。

甲型流感病毒血凝素头部蛋白结构域的原核表达及血清学分析

目的在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中,通过IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白,验证表达的准确性,Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白,多剂次免疫家兔,获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时,重组蛋白免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。结果rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体,可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体,可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原,在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体,可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。

H1N1疫苗株在MDCK和MDCK-G1细胞中的培养条件比较

目的比较H1N1流感病毒疫苗株在MDCK和MDCK-G1细胞中的最佳培养条件、产毒量、病毒滴度和细胞代谢情况。方法通过棋盘法摸索两种细胞的最佳种毒条件,然后比较2株细胞在最佳条件种毒后的血凝滴度、半数组织感染剂量(TCID50)、葡萄糖和乳酸的代谢情况。结果MDCK-G1细胞以感染复数(MOI)=0.001、1μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后,72 h时血凝滴度达到峰值(1∶512),病毒滴度为107.4TCID50/ml;MDCK细胞以MOI=0.0001、1μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后,72 h时血凝滴度达到峰值(1∶256),病毒滴度为106.6TCID50/ml。结论MDCK-G1比MDCK细胞更适合流感病毒的增殖。本研究为细胞基质流感疫苗的研究提供了参考数据。