哺乳动物雷帕霉素靶蛋白重组RNAi慢病毒载体的构建

目的构建哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)重组RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体。方法按照RNAi设计规则,针对mTOR基因设计4个干扰靶点和阴性对照序列(FAM),先用人工合成寡核甘酸片段,通过PCR拼接的方法,即可获得小干扰RNA(siRNA)有效片段,采用Lipofectamine 2000转染试剂,对肺腺癌A549细胞进行转染,1d后,通过高倍荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白在肺腺癌A549细胞中的表达情况。采用半定量RT-PCR方法,检测mTOR基因在1d后mRNA水平的表达,采用Western blot检测2d后蛋白表达水平,从而筛选出最高效的干扰靶序列,将其合成双链DNA,通过pGCL-GFP载体,与pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共同组成载体系统,进一步转染293T细胞,最终包装后产生慢病毒,通过Western blot方法检测GFP蛋白表达水平来检测293T细胞中的病毒滴度,并进行活性鉴定。结果 mTOR基因的高效siRNA干扰靶点被成功筛选出;mTOR siRNA感染体外培养的人肺腺癌A549细胞后,不管是从mRNA水平,还是蛋白水平,该基因都明显沉默;该基因mTOR siRNA的慢病毒载体被成功构建,同时收获病毒上清,并检测出病毒滴度为1×108 UT/mL。结论 mTOR siRNA感染体外培养的人肺腺癌A549细胞,能够导致mTOR基因明显沉默;该基因mTOR siRNA的慢病毒载体被成功构建。