α-常春藤皂苷协同雷公藤红素对SMMC7721肝癌细胞增殖和周期的影响

目的 探索α-常春藤皂苷协同雷公藤红素对SMMC7721肝癌细胞增殖和周期的影响。方法 MTT法检测细胞存活率,CompuSyn软件获取相互作用指数(CI)并筛选出最佳协同组合。流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、周期蛋白依赖性激酶(CDKs)和细胞周期蛋白(Cyclins)的表达。结果 单用α-常春藤皂苷或雷公藤红素均能抑制细胞增殖,且呈剂量依赖性;作用48 h后,当α-常春藤皂苷质量浓度为10.0μg/mL,雷公藤红素质量浓度为0.30μg/mL时,CI值为0.24,协同效应最佳。在以上质量浓度条件下,协同组早期凋亡率高于其余3组(P<0.05)。α-常春藤皂苷组及协同组晚期凋亡率高于对照组(P<0.05);总凋亡率以协同组最高且高于对照组(P<0.05)。雷公藤红素及协同组G_(0)/G_(1)期比例较对照组升高(P<0.05);α-常春藤皂苷组S期比例较对照组升高(P<0.05);协同组G_(1)+S期总比例最高且高于对照组(P<0.05)。与对照组比较,各给药组Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2比值无明显变化(P>0.05);协同组CDK2和CDK4蛋白表达降低(P<0.05);雷公藤红素组和协同组Cyclin D1表达均升高(P<0.05);各给药组Cyclin E1表达均升高(P<0.05)。结论 α-常春藤皂苷协同雷公藤红素抑制SMMC7721细胞增殖效应确切,该效应可能与诱导G_(0)/G_(1)期周期阻滞、G_(1)+S期总比例增加有关,而Cyclin D1可能是参与其中的关键分子。

预知子联合雷公藤红素对肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用及对NF-κB通路的影响

目的 观察预知子联合雷公藤红素对肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用及对核因子(NF)-κB通路的影响,并探讨其作用靶点。方法 皮下接种肝癌SMMC7721细胞建立荷瘤裸鼠模型,将裸鼠随机分为模型对照组、预知子提取物组、雷公藤红素组和联合组,将药物包载于壳聚糖/甘油磷酸钠温敏性凝胶系统,分别于分组后第1、6、11日经皮瘤内注射相应药物,共3次。每2日测量裸鼠体质量和瘤径,第16日称量瘤体及肝、脾、左肾脏器质量,计算瘤指数、抑瘤率及脏器指数;ELISA测定血清肿瘤坏死因子(TNF)-α含量;HE染色观察瘤组织形态变化;Western blot检测瘤组织NF-κB通路相关蛋白表达。结果 与模型对照组比较,各给药组裸鼠体质量、去瘤体质量、瘤体积、瘤质量和瘤指数均呈下降趋势,其中以雷公藤红素组最为显著(P<0.05),联合组瘤体积和瘤质量显著下降(P<0.05),各给药组裸鼠肝和左肾质量及指数均显著下降(P<0.05),预知子提取物组、雷公藤红素组和联合组抑瘤率分别为6.68%、35.08%和22.00%;各给药组裸鼠血清TNF-α含量显著增加(P<0.05);HE染色显示,各给药组裸鼠瘤组织均出现间质增多现象,且联合组部分区域出现炎症细胞浸润、堆积;Western blot结果显示,雷公藤红素组裸鼠瘤组织IκB激酶α(IKKα)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、周期蛋白D1(Cyclin D1)、NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.05),联合组裸鼠瘤组织NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和p-IκBα蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 预知子联合雷公藤红素能抑制肝癌荷瘤裸鼠肿瘤生长,NF-κB通路p-IκBα分子可能是二者联合发挥抑瘤作用的重要靶点。

预知子醇提物联合雷公藤红素对SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的观察预知子醇提物联合雷公藤红素对SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。方法将不同浓度预知子醇提物和雷公藤红素分别作用于SMMC7721细胞72 h,MTT法获得细胞存活率、72 h IC50后,计算药物相互作用指数(CDI)。将SMMC7721细胞分为空白对照组、预知子醇提物组、雷公藤红素组和预知子醇提物+雷公藤红素组(联合组),光镜观察细胞形态,荧光显微镜观察细胞核形态,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测线粒体凋亡途径、内质网应激途径、自噬相关和线粒体-内质网结构偶联(MAM)相关蛋白的表达。结果预知子醇提物和雷公藤红素72 h IC50剂量CDI值为0.45,存在显著协同效应。联合组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞形态发生改变,且部分细胞核呈碎块状,细胞凋亡率较其余3组显著升高(P<0.05)。与空白对照组比较,雷公藤红素组和联合组线粒体凋亡相关蛋白Caspase-3表达明显降低(P<0.05),联合组cleaved Caspase-3表达明显降低(P<0.05),预知子醇提物组内质网应激相关蛋白Grp78表达明显降低(P<0.05),雷公藤红素组和联合组Grp78蛋白表达明显升高(P<0.05);联合组Chop蛋白表达较其余3组均明显升高(P<0.05);与空白对照组比较,预知子醇提物组和联合组自噬相关蛋白p62、LC3BⅡ及LC3BⅡ/Ⅰ比值均显著升高(P<0.05),各给药组MAM标志物Mfn2表达均升高但差异无统计学意义(P>0.05)。结论预知子醇提物联合雷公藤红素可抑制SMMC7721细胞增殖、诱导细胞凋亡,预知子醇提物和雷公藤红素作用靶点不尽相同;二者的一致性效应机制方面,除Caspase-3和cleaved Caspase-3、Chop和Mfn2等分子外,尚需进一步扩大关注面。

预知子醇提物联合姜黄素抑制肝癌细胞增殖协同效应及机制探索

目的探讨预知子醇提物(AFE)与姜黄素(CUR)联用抑制SMMC7721肝癌细胞增殖协同效应及机制。方法将不同浓度预知子醇提物AFE(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L^(-1))和姜黄素CUR(25.0、20.0、15.0、10.0、5.0μmol·L^(-1))分别作用于SMMC7721肝癌细胞72h,噻唑蓝法(MTT)获得细胞存活率;在此基础上进一步设置不同浓度9种组合,以药物相互作用指数(Coefficient of Drug Interaction,CDI)为标准筛选最佳协同效应组合,同时设置空白以及各自等剂量单药对照组,进一步采用光镜观察细胞形态、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(WB)检测线粒体和内质网应激凋亡、死亡受体途径相关蛋白表达量。结果(1)AFE 72h IC50为2.09 g·L^(-1);CUR 72h IC50为16.90μmol·L^(-1);(2)AFE 1.5 g·L^(-1)+CUR 15.0μmol·L^(-1)组合协同效应最佳,CDI值为0.74±0.06;(3)细胞形态方面,AFE作用后细胞增殖被抑制且出现ERS空泡样表现,CUR作用后细胞增殖被抑制但无相同形态变化,协同组类似二者效果的叠加;(4)AFE、CUR单独作用凋亡现象基本不出现,协同组诱导细胞凋亡现象则被显著增强,凋亡率显著高于其它3组(P<0.05);(5)协同组Bcl-2较对照和CUR组显著上升(P<0.05);AFE下调Caspase-9表达(P<0.05);Cleaved Caspase-9和Parp1均呈下降趋势,其中大片段Cleaved Parp1和小片段Cleaved Parp1均被CUR显著下调(P<0.05),但后者被AFE和协同组显著上调(P<0.05);AFE显著下调Bip表达(P<0.05);Chop在各用药组中表达量均被下调(P<0.05),且在协同组低于各单药组(P<0.05);p-JNK在AFE和协同组均被上调(P<0.05);IKBα在CUR和协同组均被上调(P<0.05),且协同组高于各单药组(P<0.05)。结论预知子醇提物和姜黄素联合抑制肝癌细胞增殖协同效应确切;线粒体和内质网应激凋亡、死亡受体途径上,Bcl-2,Parp1,Chop、IKBα等诸多标志性分子可能参与该过程。

顺铂短期给药诱发小鼠药源性虚证模型的评价研究

目的:研究顺铂短期给药诱发小鼠药源性证候的属性及对类固醇激素合成功能的影响。方法:40只雄性ICR小鼠随机分为对照组及顺铂不同剂量(3、5、10 mg·kg^(-1)·d^(-1))组,每组10只。各药物干预组小鼠腹腔注射相应剂量的顺铂,连续5 d。分别于干预5 d后和停药5 d后,观察小鼠体征(体质量、摄食量、腋温、爪色泽),并进行行为学测试(抓力、旷场试验和转棒试验)。观察期后,取血清;分离肾脏、心脏、胸腺和脾脏,计算脏器指数;收集肾上腺和睾丸。ELISA检测血清皮质酮和睾酮含量;HE染色后光镜下观察肾上腺与睾丸组织形态学变化;PCR、Western blot分别检测肾上腺皮质类固醇激素合成酶和睾丸睾酮合成酶相关的mRNA、蛋白表达。结果:(1)干预5 d后,顺铂10 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠体质量、摄食量、腋温、水平运动及垂直运动较对照组均显著降低(P<0.05,P<0.01);顺铂3、5 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠腋温明显低于对照组,而爪色r值高于对照组(P<0.05,P<0.01)。停药5 d后,顺铂10 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠体质量、摄食量、在棒时间、抓力、腋温、爪色r值、水平运动及垂直运动较对照组均显著降低(P<0.05,P<0.01);顺铂3、5 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠垂直运动较对照组亦明显减少(P<0.01)。(2)与对照组相比,10 mg·kg^(-1)·d^(-1)顺铂作用显著抑制小鼠脾脏、胸腺、心脏,脏器指数明显降低(P<0.05,P<0.01),而肾脏指数显著升高(P<0.01);5 mg·kg^(-1)·d^(-1)顺铂作用亦抑制心脏(P<0.05)。(3)形态学观察显示,顺铂10 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠肾上腺皮质球状带细胞肿胀明显,顺铂5、10 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠可见各级生精细胞排列略紊乱,睾丸间质细胞收缩明显。(4)与对照组相比,顺铂10 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠血清皮质酮含量显著升高(P<0.01),血清睾酮含量无明显变化。(5)与对照组相比,顺铂3 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠肾上腺Star、Cyp21a1的mRNA表达受到抑制(P<0.05),而顺铂10 mg·kg^(-1)·d^(-1)组小鼠肾上腺Star、Cyp11b1、Cyp21a1的mRNA表达及StAR、CYP21A2、CYP11B1蛋白表达显著上调(P<0.05,P<0.01)。(6)与对照组相比,10 mg·kg^(-1)·d^(-1)顺铂作用显著抑制睾丸StAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B2的mRNA与蛋白表达(P<0.05,P<0.01);5 mg·kg^(-1)·d^(-1)顺铂干预显著抑制Star和Hsd3b2的mRNA表达(P<0.05,P<0.01);3 mg·kg^(-1)·d^(-1)顺铂作用亦显著抑制Cyp17a1和Hsd3b2的mRNA表达(P<0.01)。结论:顺铂短期给药可诱发小鼠虚证表现,以精气亏虚为主,其物质基础与类固醇激素合成及储备下降有关。